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定序間的釘孤枝!–淺談次世代基因定序技術

活躍星系核_96
・2015/05/26 ・2696字 ・閱讀時間約 5 分鐘 ・SR值 535 ・七年級
圖片來源:illumina blog
圖片來源:illumina blog

文/板橋笑笑生包博

次世代基因定序技術已然發展10年,而為什麼叫做次世代(Next-Generation)呢?那第一代去哪裡了?我為何要關心次世代定序技術?乾我何事?要回答到你懂這些問題以前,你必須必備大一生物學;不難拉,大概有點概念就可以。再來要有基礎的統計學概念以及數理概念,一樣不難拉,高中程度就可以。可是你問我,我高中都在談戀愛怎辦?沒關係,就讓我娓娓道來。

華生與克利克在1953年發表於Nature雜誌,確定了DNA的雙股螺旋結構;這個發現就好像神眉老師拿下手套解除封印一樣,從此開始分子生物技術時代來臨,我們不再是以巨觀的方式去探討遺傳、疾病的發生、生物演化等等的一切生物學上難解的問題。

DNA(去氧核糖核酸)是什麼?沒看過DNA你也吃過DNA吧?男孩最喜歡餵女孩吃DNA了,別想歪,我是說任何有機食物的成分裡面都有DNA因為DNA是構成有機體最基本的物質。DNA由碳氫磷所構成分別有4種形式有A(腺嘌呤),C(胞嘧啶),G(鳥嘌呤),T(胸腺嘧啶)。這四種碳氫磷糖類很有趣的只有AT會在一起GC會在一起。所以依造這種特性構成的DNA雙股螺旋就會呈現互補的狀況也就是比方說你拿到一股是ATGGGCCAT你的互補股就會是TACCCGGTA。而在DNA進行複製時會有許多酶的參與其中,包括DNA聚合酵素(polymerase ),這傢伙就是負責生出互補股就對了。

所以根據這個酵素的特性,天才大師桑格發明了人類史上第一個定序法此稱桑格法。桑格也因此獲得諾貝爾獎。桑格法的開發讓我們得以從基本面去看生物體表現,也就是說從微觀的DNA序列開始了解起生物體的化學表現。桑格法的原理其實說穿了就是應用聚合酶的特性,但是桑格在反應劑裡加上了ddNTP也就是ATGC的dd版,而這dd版就像個停止訊號,就像帶著婚戒的辣妹一樣,你想跟他聚合聚合卻不行,所以聚合酶就在ddNTP前面停住了。而桑格在這些dd版的ATGC上面標上放射元素但後期改良成螢光,所以不同顏色會代表不同的ATGC。如果不了解,這裏有youtube 動畫:

而桑格法開發完之後大家開始想,這方法會不會太慢啊,定一次序列只有幾十個ATGC有沒有更快的方法?霰彈槍定序法Shotgun sequencing)的出現除了奠基於桑格法,還要拜電腦科技進步所賜。你可以想像成它會收集鋪滿在一張大桌子上的桑格反應的終止短序列,並同時邊用電腦的演算法把序列像拼圖一樣一片片拼湊起來。人類基因組計畫就是在此狀況下達成的而當時的主力技術就是霰彈槍定序法

圖片來源:wikimedia; open source
圖片來源:wikimedia; open source

在當時火紅的霰彈槍定序法推出來後,各國聯手定出人類的基因序,這些龐大的資金與經濟力量促進此科技更長足的進步也就是次世代定序(Next Generation Sequencing, NGS)的到來。次世代定序已經發展十年餘,這十年內群雄並立,各有各的長處與劣勢但是illumina這間公司在十來年的發展之下幾乎佔滿90%的NGS市場,可以稱NGS界的英代爾。

illumina的原理基本上就是把shotgun縮小在一個小小盤子上,上面有著幾億個小小短片段訊號。然後根據這些短片段訊號再藉由一些演算法,把它拼成一個完整序列。illumina雖然能換來相當於95%準確的基因序列,但伴隨著的大量短片段在統計上就算是用大型運算電腦也需要花掉不少的時間。

當大家覺得illumina即將一統江山時,有個挑戰者Pacific Bioscience帶著新的科技挑戰市場也代表著挑戰illumna的領域。Pacific Bioscience也簡稱PacBio,PacBio剛宣布上市時,股價可以用火箭升天來形容為什麼?因為他跨時代的科技概念。

PacBio創造的片段是illumina的十倍甚至是百倍長,所以可以更快速的把基因體定序完成。聽起來PacBio像是統一中原的最佳人選,但是事與願違PacBio的火雲神功裡面有幾招破綻:也就是他們創造的超長片段裡有著將近13%的錯誤率。在這消息被揭露之後,PacBio的股價瞬間跌落,雖然PacBio不斷的加長他們的片段到現在幾乎可以一次讀出20000個ATGC。這是一個很了不起的成就,但是因為高錯誤率,所以普遍業界並不採用。

illumina已經虎視眈眈要吞併PacBio讓他們再也沒有立足之地,從此傲笑江湖!但是……..illumina緩慢的拼圖速度讓很多研究人員送出檢體後只能乾等。開始慢慢有人開始研究將兩種科技合併使用的可能:比如Koren at el. 在2012年投稿Nature Biotechnology所提出的混合法也就是先用illumina短片段去糾正PacBio的長片段。

此方法獲得廣大迴響。而PacBio在2013年也提出了一套解決非混合法,意即PacBio only的解法刊登於Nature Method 。這稍稍為PacBio帶來曙光,但卻失去PacBio 該有的速度。因為此解法就是藉由製造更多拼圖重複的貼到同一個區域,好比提升照相機在夜晚中照相的功能你得提升曝光時間,也就是因此犧牲了火雲神功的速度。

天下武功唯快不破,當PacBio失去速度,就再也不是火雲神功了。連帶的要提升解析度,客戶相對要付出更多人力物力財力才能達到普遍的準確度要求。這場NGS在科技,思想與商業模式上的競爭,illumina佔了大上風,但對於科學家與企業家來說,大衛挑戰哥利亞的故事卻是我們引頸期待的,但不管如何NGS公司間的競爭帶給我們更多機會與更便宜的科技去探討生物體的過去與未來,並且對於藥物以及疫苗的研發帶來更大的幫助。

參考資料:

  1. 腺嘌呤胞嘧啶鳥嘌呤胸腺嘧啶, wiki
  2. Polymorase, wiki
  1. Sanger method
  2. WGS 
  3. 人類基因體計畫, wiki
  4. shotgun sequencing , wiki
  5. illumina
  6. pacbio
  7. Hybrid Method , 01 July 2012 [Nature Biotechnology]
  8. HPWG

_____________________________________

作者簡介
dfwef姓名:簡榮廷  筆名:板橋笑笑生包博
email: jtchien0925@gmail.com 以及 jchien2@emory.edu
美國艾默里大學(Emory University)電腦科學-生物醫學資訊組博士候選人。費德智庫共同創辦人。Sequegenic 生技公司共同創辦人。專長次世代定序科技,機器學習與數據探勘,生物醫學技術,系統生物學。目前於National Yerkes Primate Research Center 之 Malaria Host-Pathogen Interaction Center 團隊下進行瘧疾研究,從基因體學,系統生物學到流行病學全方位更深入的研究瘧疾以期瞭解其機轉並帶動疫苗以及藥物之研發。

文章難易度
活躍星系核_96
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活躍星系核(active galactic nucleus, AGN)是一類中央核區活動性很強的河外星系。這些星系比普通星系活躍,在從無線電波到伽瑪射線的全波段裡都發出很強的電磁輻射。 本帳號發表來自各方的投稿。附有資料出處的科學好文,都歡迎你來投稿喔。 Email: contact@pansci.asia


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什麼是「造父變星」?標準燭光如何幫助人類量測天體距離?——天文學中的距離(四)

CASE PRESS_96
・2021/10/22 ・3033字 ・閱讀時間約 6 分鐘
  • 撰文|許世穎

「造父」是周穆王的專屬司機,也是現在「趙」姓的始祖。以它為名的「造父變星」則是標準燭光的一種,讓我們可以量測外星系的距離。這幫助哈柏發現了宇宙膨脹,大大開拓了人們對宇宙的視野。然而發現這件事情的天文學家勒梅特卻沒有獲得她該有的榮譽。

宇宙中的距離指引:標準燭光

經過了三篇文章的鋪陳以後,我們終於要離開銀河系,開始量測銀河系以外的星系距離。在前作<天有多大?宇宙中的距離(3)—「人口普查」>中,介紹了距離和亮度的關係。想像一支燃燒中、正在發光的蠟燭。距離愈遠,發出來的光照射到的範圍就愈大,看起來就會愈暗。

我們把「所有發射出來的光」稱為「光度」,而用「亮度」來描述實際上看到的亮暗程度,而它們之間的關係就是平方反比。一旦我們知道一支蠟燭的光度,再搭配我們看到的亮度,很自然地就可以推算出這支蠟燭所在區域的距離。

舉例來說,我們可以在台北望遠鏡觀測金門上的某支路燈亮度。如果能夠找到到那支路燈的規格書,得知這支路燈的光度,就可以用亮度、光度來得到這支路燈的距離。如果英國倫敦也安裝了這支路燈,那我們也可以用一樣的方法來得知倫敦離我們有多遠。

我們把「知道光度的天體」稱為「標準燭光(Standard Candle)」。可是下一個問題馬上就來了:我們哪知道誰是標準燭光啊?經過許多的研究、推論、歸納、計算等方法,我們還是可以去「猜」出一些標準燭光的候選。接下來,我們就來實際認識一個最著名的標準燭光吧!

「造父」與「造父變星」

「造父」是中國的星官之一。傳說中,「造父」原本是五帝之一「顓頊」的後代。根據《史記‧本紀‧秦本紀》記載:造父很會駕車,因此當了西周天子周穆王的專屬司機。後來徐偃王叛亂,造父駕車載周穆王火速回城平亂。平亂後,周穆王把「趙城」(現在的中國山西省洪洞縣一帶)封給造父,而後造父就把他的姓氏就從本來地「嬴」改成了「趙」。因此,造父可是趙姓的始祖呢!(《史記‧本紀‧秦本紀》:造父以善御幸於周繆王……徐偃王作亂,造父為繆王御,長驅歸周,一日千里以救亂。繆王以趙城封造父,造父族由此為趙氏。)

圖一:危宿敦煌星圖。造父在最上方。圖片來源/參考資料 2

回到星官「造父」上。造父是「北方七宿」中「危宿」的一員(圖一),位於西洋星座中的「仙王座(Cepheus)」。一共有五顆恆星(造父一到造父五),清代的星表《儀象考成》又加了另外五顆(造父增一到造父增五)。[3]

英籍荷蘭裔天文學家約翰‧古德利克(John Goodricke,1764-1786)幼年因為發燒而失聰,也無法說話。1784 年古德利克(John Goodricke,1764-1786)發現「造父一」的光度會變化,代表它是一顆「變星(Variable)」。2 年後,年僅 22 歲的他就當選了英國皇家學會的會員。卻在 2 週後就就不幸因病去世。[4]

造父一這顆變星的星等在 3.48 至 4.73 間週期性地變化,變化週期大約是 5.36 天(圖二)。經由後人持續的觀測,發現了更多不同的變星。其中一群變星的性質(週期、光譜類型、質量……等)與造父一接近,因此將這一類變星統稱為「造父變星(Cepheid Variable)」。[5]

圖二:造父一的亮度變化圖。橫軸可以看成時間,縱軸可以看成亮度。圖片來源:ThomasK Vbg [5]

勒維特定律:週光關係

時間接著來到 1893 年,年僅 25 歲的亨麗埃塔‧勒維特(Henrietta Leavitt,1868-1921)她在哈佛大學天文台的工作。當時的哈佛天文台台長愛德華‧皮克林(Edward Pickering,1846-1919)為了減少人事開銷,將負責計算的男性職員換成了女性(當時的薪資只有男性的一半)。[6]

這些「哈佛計算員(Harvard computers)」(圖三)的工作就是將已經拍攝好的感光板拿來分析、計算、紀錄等。這些計算員們在狹小的空間中分析龐大的天文數據,然而薪資卻比當時一般文書工作來的低。以勒維特來說,她的薪資是時薪 0.3 美元。順帶一提,這相當於現在時薪 9 美元左右,約略是台灣最低時薪的 1.5 倍。[6][7][8]

圖三:哈佛計算員。左三為勒維特。圖片來源:參考資料 9

勒維特接到的目標是「變星」,工作就是量測、記錄那些感光板上變星的亮度 。她在麥哲倫星雲中標示了上千個變星,包含了 47 顆造父變星。從這些造父變星的數據中她注意到:這些造父變星的亮度變化週期與它們的平均亮度有關!愈亮的造父變星,變化的週期就愈久。麥哲倫星雲離地球的距離並不遠,可以利用視差法量測出距離。用距離把亮度還原成光度以後,就能得到一個「光度與週期」的關係(圖四),稱為「週光關係(Period-luminosity relation)」,又稱為「勒維特定律(Leavitt’s Law)」。藉由週光關係,搭配觀測到的造父變星變化週期,就能得知它的平均光度,能把它當作一支標準燭光![6][8][10]

圖四:造父變星的週光關係。縱軸為平均光度,橫軸是週期。光度愈大,週期就愈久。圖片來源:NASA [11]

從「造父變星」與「宇宙膨脹」

發現造父變星的週光關係的數年後,埃德溫‧哈柏(Edwin Hubble,1889-1953)就在 M31 仙女座大星系中也發現了造父變星(圖五)。數個世紀以來,人們普遍認為 M31 只是銀河系中的一個天體。但在哈柏觀測造父變星之後才發現, M31 的距離遠遠遠遠超出銀河系的大小,最終確認了 M31 是一個獨立於銀河系之外的星系,也更進一步開拓了人類對宇宙尺度的想像。後來哈柏利用造父變星,得到了愈來愈多、愈來愈遠的星系距離。發現距離我們愈遠的星系,就以愈快的速度遠離我們。從中得到了「宇宙膨脹」的結論。[10]

圖五:M31 仙女座大星系裡的造父變星亮度隨時間改變。圖片來源:NASA/ESA/STSci/AURA/Hubble Heritage Team [1]

造父變星作為量測銀河系外星系距離的重要工具,然而勒維特卻沒有獲得該有的榮耀與待遇。當時的週光關係甚至是時任天文台的台長自己掛名發表的,而勒維特只作為一個「負責準備工作」的角色出現在該論文的第一句話。哈柏自己曾數度表示勒維特應受頒諾貝爾獎。1925 年,諾貝爾獎的評選委員之一打算將她列入提名,才得知勒維特已經因為癌症逝世了三年,由於諾貝爾獎原則上不會頒給逝世的學者,勒維特再也無法獲得這個該屬於她的殊榮。[12]

本系列其它文章:

天有多大?宇宙中的距離(1)—從地球到太陽
天有多大?宇宙中的距離(2)—從太陽到鄰近恆星
天有多大?宇宙中的距離(3)—「人口普查」
天有多大?宇宙中的距離(4)—造父變星

參考資料:

[1] Astronomy / Meet Henrietta Leavitt, the woman who gave us a universal ruler
[2] wiki / 危宿敦煌星圖
[3] wiki / 造父 (星官)
[4] wiki / John Goodricke
[5] wiki / Classical Cepheid variable
[6] wiki / Henrietta Swan Leavitt
[7] Inflation Calculator
[8] aavso / Henrietta Leavitt – Celebrating the Forgotten Astronomer
[9] wiki / Harvard Computers
[10] wiki / Period-luminosity relation
[11] Universe Today / What are Cepheid Variables?
[12] Mile Markers to the Galaxies

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CASE的全名是 Center for the Advancement of Science Education,也就是台灣大學科學教育發展中心。創立於2008年10月,成立的宗旨是透過台大的自然科學學術資源,奠立全國基礎科學教育的優質文化與環境。
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