想重現侏儸紀公園？先征服古代 DNA 的種種難題！

大家好！打ㄍㄟ厚！胎軋後！各位如果常常追蹤寒波的粉絲團「盲眼的尼安德塔石器匠」，想必對藉由分析古代生物的 DNA，來探討生物演化或是人類遷徙有些認識。但是有人想過這樣的研究是怎麼辦到的嗎？

古代 DNA（ancient DNA, aDNA）研究或古遺傳學（paleogenetics），算是生物學，特別是演化生物學中的研究領域之一。一般指的是最初並非以萃取 DNA 為目標的標本中獲取，再利用特殊方法重建的遺傳資料。藉此重建保存條件不佳的 DNA，並將結果與當代生物的遺傳資訊合併分析，例如，〈冰河期前後智人大移民，其中一群人卻消失了？！〉、〈幾萬年前就是好朋友？在北極發現狗的可能始祖〉都是這類研究的成果。

值得注意的是，雖然我們使用古基因組這樣的詞彙，但這個領域的研究對象並不限於古代的生物，廣義來說，只要樣本的來源不是為了遺傳研究而採集（像博物館中的動植物標本），就算研究的對象不是古代生物，得到的 DNA 依舊可以稱之為古代 DNA。因為 Ancient DNA 資料能具體的呈現研究的生物在過去特定時間點遺傳組成，所以可以讓我們更加了解生物到底是如何變成我們目前看到的模樣。

班驢，又是一個無緣再相見的動物，至少你的 DNA 在科學史上記了一筆。（班驢：馬的！那我讓你在科學史上記一筆你滅種給我看啊！）圖／Wikipedia

古 DNA 研究怎麼開始的？

古代DNA研究的起步相當晚，第一個成功的例子在 1984 年，科學家藉由博物館中的動物肌肉標本，重現當時已絕種將近 100 年的斑驢 DNA（quagga，一種斑馬的近親）。隔年，舉世聞名的 Svante Pääbo（沒錯！！就是《尼安德塔人：尋找失落的基因組》的作者帕波）發表了埃及木乃伊的 DNA 片段，立即吸引了大眾的矚目。

對研究者來說，這個全新的資訊來源可以讓他們回答之前無法探討的問題（科學家顯示摩拳擦掌中！！），而流行文化也立即跟上這股風潮，開始想像複製出古生物的可能性，最有名的就是恐龍災難大片《侏儸紀公園》啦！這部經典電影，因為有古生物學家指導此片的拍攝，對大眾傳達了相對正確的演化理論，但是在古代 DNA 研究的概念上（從蚊子中提煉出了恐龍 DNA 那段），卻也低估了古基因組研究過程中的困難。

在早期古基因組重建領域中，帕波是首屈一指的人物。從前述所提到的埃及木乃伊研究開始，到後來讓他揚名立萬的尼安德塔人基因組重建，他的團隊開發了一系列的方法來建立古代 DNA 研究的實驗流程，再配合當時新的 PCR 技術，可以快速擴增目標的 DNA 片段，讓標本的 DNA 重建似乎變得更容易了（詳情請參閱〈尼安德塔人：尋找失落的基因組……科學界30年第一手內幕揭秘〉）。越來越多科學家也加入重建古代DNA的行列，每個人都在比賽誰可以定出最古老的DNA序列……直到那黑暗時期的到來。

豆知識：雖然叫侏儸紀公園，但是暴龍（T-Rex）實際上是生存在白堊紀非侏羅紀喔！揪咪~ 圖／Wikipedia

一個火雞三明治引發的疑案

這段「黑暗時期」，指的是許多已發表的古代 DNA 研究，最後被證明結果有問題。這包括 1600 萬年前的木蘭化石、琥珀中兩千五百萬到一億兩千萬年前的細菌序列（這情境有沒有一種似曾相識的感覺），都發生實驗結果無法複製的問題。

另一個相當有名的例子發生在 1994 年，有個美國團隊宣稱他們從恐龍的化石，經過 2880 次的 PCR 後，重建出大約 170 個核苷酸長的「恐龍 DNA」。而且這段序列與現存生物的 DNA 相互比較後，發現親緣關係最近的是鳥類，更精確來說是——火雞。這項發現相當符合恐龍與鳥類有最近共同祖先的認知，所以被認為是重要的證據。但後來卻發現這項結果無法被其他研究團隊複製。所謂的「可以複製」，代表他人能夠用作者提供的研究方法和材料重現實驗結果。後續討論中，有人提到「……直到現在，發現恐龍 DNA 的團隊都還在懷疑當時的實驗結果，是否來自他們曾經在實驗室吃過的火雞三明治……」，這些可疑的結果為當時正起步的古代DNA研究蒙上陰影。

各種可能改變DNA的情況

事後科學家從「火雞三明治事件」，與其他失敗的實驗中取得許多教訓。

外來 DNA 汙染

第一個就是實驗汙染。實驗汙染這個問題要跟 PCR 在古代 DNA 上的使用，以及實驗方法一起討論。從生物死亡的瞬間開始，DNA 開始逐漸降解，碎成小段，太短的片段是無法進行 PCR 的，所以樣本中真的可以用來 PCR 的 DNA 片段濃度很低，跟附近環境中的 DNA 數量沒得比。

為了能夠與現在的物種相比較，研究者大多是選用與現生生物類似的基因片段重建。But，人生就是這個 but！ 現代生物也有一樣 DNA 啊！畢竟 PCR 酵素不會專挑古代 DNA 來擴增，實驗過程中一開始只要有輕微的環境汙染，現代與與古代樣本間 DNA 數量上的差異就會讓 PCR 的結果完全改變。以「火雞三明治事件」為例，經過 2880 次的 PCR，你想那些輕微的污染會被放大到甚麼程度？

你有辦法找到真正的鳴人，我就可以找出古代DNA。圖／Animen

PCR 的技術限制

以 PCR 來重建標本的 DNA 序列還有另一個限制，就是 PCR 一次只能重建一個到數個片段，古代 DNA 往往樣本稀少，如果以建立某個標本完整的一段基因為目標，很可能 PCR 還沒做幾次，材料就用完了。以一段約 600 鹼基對長的基因為例，如果用傳統 PCR 的做法，必須將這段基因分成五個片段 PCR，每次 PCR 的結果都要分別定序，再重新排列組成基因。相當耗費時間與人力。

DNA 的劣化

與新鮮的樣本不同，古代 DNA 因為本身的特質跟不良的保存條件，所以萃取的 DNA 往往質量不佳。生物死後，會讓 DNA 的特性跟結構改變，這個機制叫 DNA 死後降解（post-mortem DNA degradation）。除了會發生前述提到的 DNA 分子鍵結斷裂、嘌呤從長鏈分子上脫落、核苷酸的碳環斷裂（我都解釋成DNA逐漸碎掉）之外，也會發生讓不同位置的DNA黏在一起、結構變形阻止 PCR 酵素繼續複製等等千奇百怪的症頭。最有名的例子是 DNA 分子中的胞嘧啶（cytosine）會被轉置成尿嘧啶（uracil）（RNA 的組成分子之一），導致後續 PCR 擴增時原本互補序列上的分子也跟著一起被改變（DNA 錯配，misincoporation），造成定序結果錯誤，這比實驗做不出來更可怕。

但是這些DNA死後降解也能在研究上帶來貢獻，像是其中一種 DNA 損傷的型態——核苷酸鹼基去氨化（DNA deamination），可以當作辨識古代 DNA 的特徵，或是藉由 DNA 損傷在序列中出現的比例，推估到底有多少觀察到的突變是真的因為演化而產生。

標本或是古生物的DNA常常有各式奇怪的問題，像是錯配（misincoporation）就很常見。圖／Logan Kistler

影響古代 DNA 保存的因素

古代 DNA 的保存有許多先天限制。雖然直覺是樣本保存的時間越長，DNA的劣化越嚴重，但實際分析發現並不全然如此，在 DNA 開始降解的初期，隨著時間越長，DNA 劣化的程度確實隨之增加。但是當時間對 DNA 降解的影響達到高峰之後，其他的環境因子反而在後續的分解作用中扮演更重要的角色。

舉例來說，氣溫變化就是很重要的影響因子，氣溫越低、以及變化幅度越小，越有益於 DNA 保存，所以現在大部分的古代 DNA 分析樣本都來自於山區、洞穴或是北方永凍層。

另外，早期博物館標本採集時為了保鮮、防止腐敗等原因，也會添加酒精或福馬林等化學藥品（想想那個一趟採集就要花好幾年的時代~），也會影響標本中 DNA 的品質。所以有時就算是一、兩百年的博物館標本，在古代 DNA 重建的難度上還更甚於保存良好的數千年化石樣本。

而不同的分類群間，DNA 分解的效率也有差別，一般來說植物 DNA 的降解速度比動物來的快，研究者推測這可能是不同生物分解時體內微環境不同所造成，但是這方面的研究還沒有定論。

次世代定序是古代 DNA 研究的救星

值得慶幸的是，次世代定序技術（Next-generation sequencing, NGS）使得定序成本和時間明顯降低，更能有效的運用古代 DNA 帶有的資訊。NGS 的其中一個特色是可以廣泛的對全基因組定序，取得大量資料。從〈從3億到1000：3天定序是怎麼辦到的？〉可以知道，現在的分析技術跟過去完全沒辦法比。以前能定序出數個基因片段就偷笑了，現在在 NGS 的加持之下，以一般大腸桿菌基因組為例，跑兩個鐘頭的反應，就可以讀出 2 千 5 百萬個鹼基對。

與 NGS 發展交互影響的是現代資料處理能力的快速進步。電腦科技的進步與普及帶來了大幅增加的資料處理能力，也是古遺傳學得以持續發展的動力。對古代 DNA 的研究者來說，實驗室工作唯一能加強的地方只有對實驗汙染的管理，但是 DNA 降解的問題跟重組都不是在實驗室中進行，而是仰賴計算機的威力，所以很多時候資料處理跟程式運算在研究中反而佔有更高的比重。

古基因組的重組類似拼大張的拼圖，首先你會有一個已知的圖案（reference genome），以重建古基因組來說通常是來自於現生的相似物種，再將 NGS 定序出來的小片段放在合宜的位置。可是現生的物種跟真的要組合的生物還是有一定的差異，就像這拼圖雖然提供給你作品的示範圖片，但是因為內容改版，又跟盒中真的拼出來的結果有微妙的不同。這時就需要借助演算法來推測每個片段該放在拼圖的哪個位置（生物學家向電腦工程師們致上最高的敬意，敬禮！！）。

拼拼圖有作品照片可參考，生物學家的古 DNA 拼圖常常是不完整或是要自己找。圖／Youtube

此外，由於古代 DNA 的品質欠佳，在資料處理過程中需要仰賴程式過濾實驗中汙染、DNA 降解、DNA 錯配所產生的雜訊。資料處理能力的提升也代表突變誤差也可透過數理模型校正。在研究者的努力與新技術的大力加持下，讓數萬年前的尼安德塔人基因組都有機會重見天日，這個領域依舊在蓬勃的發展中。

結論

所以，侏儸紀公園真的會出現嗎？

雖然說這領域的發展日新月異，但樣本的保存期限依舊有物理極限在，而且 DNA 死後降解的速度大多是比理想中來得高的。如同我之前所提到的，過短的 DNA 片段根本無法重組。再加上也不是只要基因組重建完成就可以完整打造出胚胎。我想在可見的將來，我們暫時是看不到恐龍出現在我們眼前啦！！

圖／Logan Kistler

• 致謝：感謝 Dr. Logan Kistler、神秘友人寒波（盲眼的尼安德塔石器匠格主）與老友林佩蓉對專業內容與文章結構上的建議與修改。本文為作者參與歐盟居禮夫人人才培育計畫創新訓練網絡（Innovative Training Networks, Marie Curie Actions）之子計畫 MicroWine 所撰寫。

參考資料：

• Rizzi, Ermanno, et al. “Ancient DNA studies: new perspectives on old samples." Genet Sel Evol 44.1 (2012): 21.
• Poinar, Hendrik N., and A. Cooper. “Ancient DNA: do it right or not at all." Science 5482 (2000): 1139.
• Hoekstra, Hopi E., and Catherine L. Peichel. “Genes, Genomes, Phenotypes." The Princeton Guide to Evolution (2013): 363.