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篩檢一定要戳鼻子嗎?用吐口水取代鼻咽採樣行不行?

miss9_96
・2021/05/31 ・3320字 ・閱讀時間約 6 分鐘
圖/ENVATO ELEMENTS

COVID-19 台灣疫情大爆發,如何快速地提升篩檢量,成了迫在眉睫的議題。

美國去年傾國之力設計出各種超簡單、大規模的 PCR 篩檢運作方式。不論是儀器、制度等面向,或許我們都可以參考看看美國的做法,是否有適用於現在的台灣。

鼻咽採樣可以用吐口水取代?

現行在台灣 COVID-19 的篩檢,不論是 PCR 或是抗原快篩,多是由鼻咽採樣──棉籤插進鼻孔、深入鼻腔後,接觸鼻咽黏膜、旋轉摩擦黏膜數次,確認沾附黏膜細胞後再移出棉籤。

由於是侵入式篩檢,對某些受測者會極不舒服、疼痛,而明顯的不適感,將會降低受測意願(某些族群可能需一週 2~3 次接受採檢),且「捅鼻孔」必須由另一人協助操作,難以簡化人力。

鼻咽採樣示範影片。影/《New England Journal of Medicine
鼻咽採檢可能會引發的不適感(請參考 1:07 處)。影/莫彩曦Hailey

因鼻咽採樣可能會很不舒服、甚至誘發打噴嚏等容易傳播病毒的反射動作,因此科學家開發了「吐口水」就可檢測的方式。該方法消除了不舒服感,也減少了檢驗人員的壓力和負擔。而且非常簡單,甚至連小孩子也能自行採樣

唾液採樣示範 (請參考 2:03 處)。影/ 加拿大安大略省公共健康促進部

那唾液採樣夠準嗎?去(2020)年 9 月,美國耶魯大學團隊在頂級醫學雜誌《新英格蘭醫學期刊》(New England Journal of Medicine)發表以鼻咽和唾液採樣,進行 RT-PCR 篩檢結果比較 [1]。

結果發現,唾液裡的病毒 RNA 濃度,甚至比鼻咽的還要高——即出現症狀首日,檢測唾液的靈敏度,可能比鼻咽採樣的更加靈敏(P<0.001)(表1、圖1);換言之,兩種採樣方式的檢體,用 RT-PCR 上機後,唾液採樣抓出確診者的能力,至少相同,或強於鼻咽採樣。

而在病程進展裡,兩方式的病毒量變化,也相當接近(圖1),顯示就 RT-PCR 而言,吐口水採樣的精準、可靠性,至少和捅鼻孔採樣幾乎相同,甚至可能更靈敏。

表1:症狀首日,兩種採樣方式取得的病毒RNA濃度。資料/參考文獻1
圖1:鼻咽、唾液採樣,對 RT-PCR 的結果比較。圖/參考文獻1

而對現在台灣更重要的是,該研究邀請 495 名自認健康、無病徵的受試者,自願做唾液篩檢。其中 13 人檢出病毒 RNA,隨後由認證實驗室確診為無症狀感染者 [1]。

也就是說,唾液採樣的 RT-PCR,的確能揪出無症狀感染者!若台灣未來有需要在重點機構(如:醫院、學校等)裡進行定期篩檢,這樣的採檢能力、再加上非侵入式的優勢,對於維繫社會運作,將有極大的助益。

高通量儀器加上法規鬆綁,大規模提高篩檢量

事實上,唾液 PCR 篩檢在美國非常便利。去年中,NBA 職籃和耶魯大學合作,開發唾液 PCR 篩檢,並實際用在聯盟球員、員工身上(耶魯醫學院ESPNCBS)。

相較於鼻咽採檢,唾液採檢無痛、技術門檻低、價格低等優勢,讓人更願意接受高頻率的定期測試,可應用在重要社會運作設施,如:醫院、安養院、警消;重大社會活動,如:開學迎接學生返校;和關鍵娛樂活動,如:職籃、餐廳。甚至部分美國學校,要求所有入校人員一週至少篩檢1次,以維繫正常校園運作。

圖2:美國 NBA 職籃,資助耶魯大學醫學院開發唾液採樣 PCR 篩檢。圖/耶魯大學醫學院

而美國除了降低採樣困難度、節約人力外,似乎也在迅速提升篩檢量層面下了功夫。以加州(人口約 3953 萬)為例,疫情高峰期的每日篩檢量達 30、甚至 40 多萬(台灣每日篩檢量約 1.6 萬) [2]。這可能和較寬鬆的法規規定,以及高通量的儀器有關。

加州每日PCR篩檢量。圖/參考文獻2

在儀器方面,美國食品藥品監督管理局(FDA, U.S. Food and Drug Administration)快速地通過高性能、高通量的篩檢儀器。舉例來說,美國 Fluidigm 公司發展出的 Advanta Dx SARS-CoV-2 RT-PCR Assay,就可採用唾液檢體(體積需求少於0.1mL),並且無須再人工萃取 RNA,每日每台儀器可最多可達 6,000 個檢體(每 30 分鐘 192 個檢體)。這類高速、高通量的篩檢儀器,替美國檢驗單位提供了無後顧之憂的能量。

而在法規方面,在美國,能網購居家採樣的唾液 RT-PCR 試劑,甚至較侵入式的鼻腔採樣篩檢套件也能購得;因此在美國,若懷疑自己生病,取得檢體似乎沒有法規限制的綑綁。

然而現行在台灣,依據《傳染病防治法》第 46 條規定:「(含疑似)傳染病檢體,由醫師採檢為原則;接觸者檢體,由醫師或其他醫事人員採檢⋯⋯採檢之實施,醫事機構負責人應負督導之責⋯⋯」,換言之,即使懷疑自己染病,不論是吐口水或鼻咽採檢,都必須由醫師採樣。

此法內容之目的,雖然確保病人的權益,但在病毒重擊台灣當下,此規定無疑加重了醫療人員的負擔,也困住了台灣對 COVID-19 疫情的篩檢能量。

立法之初衷在於保護人民。然而,疫情發展至此,冀盼政府能審視資源、鬆綁法規,讓科學檢驗能騰出手腳,解救我們的家鄉。

保持冷靜,繼續前進。Keep Calm and Carry On.

備註:鼻咽採樣和唾液採樣之套件 (Kit)

鼻咽和唾液採樣的套件(kit)主體都是「無菌、無汙染的檢體承載器皿」。

簡單來說,唾液採樣套件會有「無菌、無汙染,可裝口水的有蓋管子」,其他尚有類似漏斗、協助導流口水的配件。而鼻咽採樣套件會有「無菌、無汙染,前端可沾附鼻咽黏膜細胞的棉花棒」,其他尚有可保護「採樣後棉花棒的」的塑膠管。

鼻咽採樣的套件(0:55~1:27)。From: Department of Health and Social Care

參考文獻

  1. Anne L Wyllie, John Fournier, Arnau Casanovas-Massana, et al. (2020) Saliva or Nasopharyngeal Swab Specimens for Detection of SARS-CoV-2. New England Journal of Medicine. DOI: 10.1056/NEJMc2016359
  2. The COVID Tracking Project. California

抗原快篩和 PCR 檢測的差別,看影片就知道囉!


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miss9_96
169 篇文章 ・ 566 位粉絲
蔣維倫。很喜歡貓貓。曾意外地收集到台、清、交三間學校的畢業證書。泛科學作家、科學月刊作家、故事作家、udn鳴人堂作家、前國衛院衛生福利政策研究學者。 商業邀稿:miss9ch@gmail.com 文章作品:http://pansci.asia/archives/author/miss9


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為何新冠病毒突變之後傳染力更強?——關鍵在於變異株的棘蛋白結構

研之有物│中央研究院_96
・2022/01/25 ・5088字 ・閱讀時間約 10 分鐘

本文轉載自中央研究院研之有物,泛科學為宣傳推廣執行單位。

  • 採訪撰文/寒波
  • 美術設計/林洵安

為何新冠病毒突變之後傳染力更強?

COVID-19 至今仍深深影響全人類,新冠病毒持續演化,例如曾經造成臺灣大規模社區感染的 Alpha 變異株、傳染力更強的 Delta 變異株,近期出現的 Omicron 變異株等,它們逃避免疫系統的能力都不一樣,關鍵就在不同的棘蛋白(spike protein)結構。「研之有物」專訪中央研究院生物化學研究所徐尚德副研究員,他的團隊陸續解析各種新冠病毒變異株的棘蛋白結構,不但能釐清新的突變帶來的威脅,後續也可作為研發人造抗體的指引。

徐尚德手上拿著新冠病毒的棘蛋白模型,顯示棘蛋白與兩種不同抗體結合的情況。圖/研之有物

解析新型冠狀病毒棘蛋白

COVID-19 的病原體是一種冠狀病毒,和 SARS 病毒是近親,正式命名為 SARS-CoV-2,中文常稱作新型冠狀病毒。為了知道病毒如何感染人體細胞,以及如何逃避免疫系統的辨識,我們需要進一步瞭解冠狀病毒表面的棘蛋白結構。

結構為什麼重要?因為結構會影響蛋白質功能。蛋白質是由不同的氨基酸所組成的長鏈,實際作用時會摺疊形成特別立體結構,而冠狀病毒的蛋白質中,又以棘蛋白最為關鍵。

徐尚德強調,棘蛋白是冠狀病毒暴露在表面的蛋白質之一,絕大多數被感染者的免疫系統所產生的抗體都是辨識棘蛋白。因此現今臨床使用的蛋白質次單元疫苗、腺病毒疫苗以及 mRNA 疫苗,都是以棘蛋白為基礎來研發。

Cryo-EM 讓蛋白質結構無所遁形

工欲善其事,必先利其器。解析蛋白質結構的方法很多,早期的 X 光晶體繞射(X-ray diffraction),就像將影片定格截圖,但不一定為蛋白質實際作用的狀態。

再來是核磁共振(Nuclear Magnetic Resonanc,簡稱 NMR),這是徐尚德留學深造時的專業,可以重現蛋白質在水溶液中的結構及動態,更接近實際作用的形態,可惜不適合分子量較大的分子。

目前結構生物學最具潛力的新技術是:冷凍電子顯微鏡(Cryogenic Electron Microscopy,簡稱 Cryo-EM),Cryo-EM 可以拍出原子尺度下高解析度的三維結構,此技術於 2017 年獲得諾貝爾化學獎。中研院則於 2018 年開始添購 Cryo-EM 設備,而 Cryo-EM 正是徐尚德用來解析棘蛋白結構的主要利器!

在 COVID-19 疫情爆發初期(2020 年 1 月),徐尚德就率先啟動新冠病毒的結構分析,當時他的研究團隊剛好已分析過感染貓科動物的冠狀病毒,對於解析棘蛋白結構有一定經驗,可說是贏得先機。

具體來說,如何用 Cryo-EM 解析新冠病毒的棘蛋白結構?

首先要大量培養新冠病毒、再分離、純化得到棘蛋白。接下來,將大量蛋白質樣本鋪成薄薄一層液體,之後以 -190℃ 急速冷凍,讓蛋白質分子保持凍結前的形態,最後用程式重建棘蛋白的三維影像。徐尚德譬喻,就像一匹馬在高速移動時,連續拍攝許多照片,再將照片疊加起來,重建馬的形狀。

棘蛋白的體積已經算大,假如又與其他蛋白質結合,體積將會更大。能解析如此龐大結構為 Cryo-EM 一大優點,但是也會創造很大的資料量。徐尚德強調,用 Cryo-EM 分析蛋白質結構不只做實驗,也要協調資料處理等疑難雜症。

冷凍電子顯微鏡可以紀錄同一時間下、不同狀態的蛋白質三維立體結構。圖/研之有物

關鍵 D614G 突變,讓新冠病毒棘蛋白穩定性大增

儘管已有貓冠狀病毒的經驗,徐尚德研究團隊初期仍經歷一陣摸索,一大困難在於,做實驗時發現不少棘蛋白壞掉,不再保持原本的結構。

這是因為一般取得蛋白質樣本後會置於 4°C 冷藏,但 4°C 其實不適合保存棘蛋白。接著徐尚德細心觀察到,具備 D614G 突變的棘蛋白,保存期限竟然比沒突變的棘蛋白要長,可以從 1 天增加到至少 1 週。

什麼是 D614G 突變呢?武漢爆發 COVID-19 疫情的初版新冠病毒,其棘蛋白全長超過 1200 個胺基酸,D614G 突變的意思就是:第 614 號氨基酸由天門冬胺酸(aspartic acid,縮寫為 D)變成甘胺酸(glycine,縮寫為 G)。

D614G 突變誕生後,存在感持續上升,2020 年 6 月時已經成為全世界的主流,隨後新冠病毒 Alpha、Delta 等變異株,皆建立於 D614G 的基礎上。

儘管序列僅有微小差異,許多證據指出 D614G 突變會增加新冠病毒的傳染力。有趣的是,它也能大幅增加棘蛋白在體外的穩定性。因此在研究用途上,變種病毒的棘蛋白反而容易保存,徐尚德更指出,對抗變種病毒的蛋白質次單元疫苗(subunit vaccine)穩定性也會增加。

圖片為徐尚德實驗室提供的新冠病毒模型與三種不同的棘蛋白模型,棘蛋白的主體為白色,棘蛋白的受器結合區域(receptor binding domain,RBD)為藍綠色。圖/研之有物

新冠病毒棘蛋白的「三隻爪子」:受器結合區域

徐尚德參與的一系列新冠病毒結構研究,除了棘蛋白本身,還包含棘蛋白與細胞受器 ACE2 的結合、棘蛋白和人造抗體的結合。

既然要解析結構,儀器「解析度」能看清楚多小的尺度就很重要!蛋白質結構學的常見單位是 Å(10-10 公尺),原子與原子間的距離約為 2 Å,Cryo-EM 的極限將近 1 Å,不過棘蛋白大約到 3 Å 便足以重建立體結構。

冠狀病毒如何感染宿主細胞,和結構又有什麼關係?棘蛋白位於冠狀病毒的表面,直接接觸宿主細胞受器 ACE2 的部分,稱為受器結合區域(receptor binding domain,簡稱 RBD),結構可能展現「向上」(RBD-up)或是「向下」(RBD-down)的狀態。向下,RBD 便不會接觸宿主細胞的受器,缺乏感染能力,;向上,RBD 方能結合受器,引發後續入侵。

徐尚德團隊透過冷凍電子顯微鏡,拍攝新冠病毒 Alpha 株的棘蛋白結構,其中有三類棘蛋白的 RBD 為 1 個向上(佔 73%),有一類(類別3)的棘蛋白 RBD 則是 2 個向上(佔 27%)。圖/Nature Structural & Molecular Biology

新冠病毒表面的棘蛋白有「三隻爪子」(3 RBD),RBD 有可能同時向上(3 RBD-up),也可能只有 1~2 個向上,結構會影響病毒的感染能力。更詳細地說,棘蛋白某些胺基酸位置的差異,會影響結構的開放與封閉程度。

棘蛋白向上或向下是動態的,假如能保持穩定性,延長向上的時間,也有助於新冠病毒的感染。這正是徐尚德一系列研究下來,實際觀察到不同品系的變化。

截至 2022 年 01 月 18 日的新冠病毒品系發展歷史,其中 Delta 變異株擁有最多品系,而 Omicron 變異株則開始興起。雖然 Omicron 的品系並不多,但已逐漸成為主流。圖/Nextstrain; GISAID

一網打盡所有高關注變異株的結構變化

和武漢最初的新冠病毒相比,D614G 突變帶來什麼改變呢?簡單說:棘蛋白向上的比例增加了,導致整個結構變得更加開放,增加新冠病毒對宿主受器的親合力(affinity)。

以 D614G 為基礎,接下來又獨立衍生出數款品系,皆具備多個突變,傳染力、抵抗力更強 。影響最大的是首先於英國現身的 Alpha(B.1.1.7)、南非的 Beta(B.1.351)、巴西的 Gamma(P.1),以及更晚幾個月後,於印度誕生的 Kappa(B.167.1)與 Delta(B.167.2)。Alpha 一度於世界廣傳,導致包括臺灣在內的嚴重疫情,不過隨後不敵優勢更大的 Delta。

對於上述品系,徐尚德率隊一網打盡。 Alpha 的棘蛋白結構解析已經發表於 《自然-結構與分子生物學》(Nature Structural & Molecular Biology)期刊,其餘新冠病毒變異株的論文仍在等待審查,目前能在預印網站 bioRxiv 看到,該研究一次報告 38 個 Cryo-EM 結構,刷新紀錄。

圖 a 顯示新冠病毒 Alpha 變異株棘蛋白的突變氨基酸序列,一共有 9 處突變, D614G 突變以紫色表示。
圖 b 顯示突變的氨基酸在立體結構中的位置。
圖/Nature Structural & Molecular Biology

Alpha 變異株的 RBD 向上結構穩定

一度入侵台灣造成社區大規模感染的 Alpha 株有何優勢?其棘蛋白除了 D614G,還多出 8 處胺基酸突變,徐尚德發現 N501Y(天門冬酰胺變成酪胺酸)、A570D(丙胺酸變成天門冬胺酸)的影響相當關鍵。

直覺地想,棘蛋白的外層結構才會與受器接觸影響傳染力,立體結構中第 570 號胺基酸的位置比較裡面,乍看並不要緊。但是徐尚德敏銳地捕捉到,A570D 突變會改變局部的空間關係,令「RBD 向上」的結構更加穩定。徐尚德形容為「腳踏板」(pedal-bin)── A570D 突變的效果就像踩著垃圾桶的腳踏板,讓桶蓋(也就是 RBD)穩定保持開啟。

事實上,棘蛋白總體向上的比例,Alpha 還比單純的 D614G 突變株更少,不過 A570D 增進的穩定性似乎優勢更大。研究團隊製作缺乏 A570D 突變的人造模擬病毒,嘗試體外感染人類細胞,發現感染力明顯減少,證實 A570D 突變頗有貢獻。

新冠病毒 Alpha 株棘蛋白的「A570D 突變」,會改變棘蛋白內部的空間,讓「RBD 向上」的結構更加穩定,就像踩著垃圾桶的腳踏板,讓桶蓋保持開啟。圖/研之有物(資料來源/徐尚德、Nature Structural & Molecular Biology

Alpha 變異株的棘蛋白親近宿主細胞,干擾抗體作用

另一個重要突變是 N501Y,不只 Alpha 有,Beta 等許多品系也有,Delta 則無。N501Y 在眾多品系獨立誕生,似乎為趨同演化所致。N501Y 能為病毒帶來哪些優勢?

第 501 號胺基酸位於棘蛋白表面,會直接與宿主受器 ACE2 結合。此一位置變成酪胺酸(tyrosine,縮寫為 Y)後,和受器的 Y41 兩個酪胺酸之間,容易形成苯環和苯環的「π–π stacking」鍵結,從而大幅提升棘蛋白對細胞的親合力。

新冠病毒 Alpha 株棘蛋白的「N501Y 突變」,讓 RBD 的胺基酸與宿主細胞受器 ACE2 形成「π–π stacking」鍵結,大幅提升棘蛋白對宿主細胞的親合力。圖/Nature Structural & Molecular Biology

另一方面,N501Y 突變也會干擾抗體的作用。中研院細胞與個體生物學研究所的吳漢忠特聘研究員,率隊研發一批針對棘蛋白的人造抗體,測試發現有一款抗體 chAb25 對 D614G 突變株相當有效,但是對 Alpha 株無能為力。徐尚德由結構分析發現:N501Y 改變了棘蛋白表面的形狀,讓抗體 chAb25 無法附著。

好消息是,另外有兩款抗體 chAb15、chAb45,依然能有效對抗 Alpha 病毒,不受 N501Y 影響。這兩款抗體會附著在棘蛋白 RBD 的邊緣,避免棘蛋白和宿主細胞接觸。而且抗體 chAb15、chAb45 會各占一方,可以同時使用,多面協同打擊病毒。

雖然新冠病毒 Alpha 株的棘蛋白表面讓某些抗體難以附著,還好仍有兩款抗體 chAb15(綠色)、chAb45(黃色)能有效「卡住」棘蛋白,干擾棘蛋白與宿主細胞結合。抗體 chAb15、chAb45 附著的位置,正好就是棘蛋白與宿主細胞結合的地方。圖/Nature Structural & Molecular Biology

棘蛋白結構不只胺基酸,還要注意表面的醣

有了 Alpha 的經驗,接下來分析 Beta、Gamma、Kappa、Delta 便順手很多。這批新冠病毒的棘蛋白變化多端,但是「RBD 向上」的整體比例皆超過 Alpha 和 D614G 突變株,可見適應上各有巧妙。徐尚德也發現,要釐清棘蛋白的結構,不能只關心蛋白質,還要考慮棘蛋白表面的醣基化(glycosylation)修飾。

蛋白質在完工後,某些胺基酸還能加上各種醣基。病毒蛋白質表面的醣基可以作為防護罩,干擾抗體和免疫系統的辨識。醣基化修飾就像替病毒訂作一套迷彩外衣,不同變異株的情況都不一樣,假如醣基化的位置和數量,由於突變而改變,便有可能影響立體結構,有助於它們閃躲抗體。例如和武漢原版新冠病毒相比,Delta 株棘蛋白少了一個醣化修飾,Gamma 株棘蛋白則多了兩處醣化。

還好從結構看來,並沒有任何突變組合能完美逃避抗體。例如由美國的雷傑納榮製藥公司(Regeneron)製作並通過緊急使用授權的抗體;以及中研院吳漢忠率隊研發,有望投入實用的多款人造抗體,對變異品系依然有效。這場人類與病毒的長期抗戰中,同時使用多款抗體的「雞尾酒」療法,仍然是可行的醫療方案。

回顧將近兩年來的研究之路,徐尚德表示:時間壓力真的非常大!COVID-19 疫情爆發後,全世界投入相關研究的專家眾多,只要稍有遲疑,便會落在競爭者後頭。但是即使跑在最前端的研究者,也只能苦苦追趕病毒演化的速度,一篇論文還在審查時,現實世界的疫情已經邁向全新局面。

人類要贏得勝利,必需全方面認識病毒,而結構無疑是相當重要的一環。


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研之有物│中央研究院_96
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