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從3億到1000:3天定序是怎麼辦到的?

葉綠舒
・2011/07/21 ・1740字 ・閱讀時間約 3 分鐘 ・SR值 418 ・四年級

還記得五月在德國開始流行的出血性大腸桿菌O104嗎?後來這隻大腸桿菌,在三天之內就定序完成,不知道有沒有人想到是怎麼辦到的啊?當時的文章裡面只提到是所謂的第三代的定序儀,但沒有說第三代的定序儀是怎麼回事,畢竟它雖然不大,但也有460萬個鹼基對(base pairs),要在三天內定序完真的是很不容易。今天在「自然」期刊上面的一篇文章,說明了第三代定序儀是怎樣辦到的。最早的定序,是使用同位素(磷32或硫35)標定的雙去氧核糖核苷酸(dideoxy nucleotide),利用DNA鏈延長需要核糖上面的3號碳的OH基與下一個核苷酸上面的磷酸根反應,當我們以人工合成3號碳上帶有H基的核苷酸(雙 去氧核糖核苷酸),並將它加入反應時,一旦DNA聚合酶抓到一個雙去氧核糖核苷酸後,會因為產生的DNA末端的3號碳不具有OH基,使DNA聚合反應終 止。接著再用凝膠電泳把一條條DNA分開後,讓乾燥的電泳膠片上面的同位素信號在X光片上面顯影,接著就是讀出序列了。

圖片來源:維基百科

上圖就是壓出來的X光片,然後我們就是一個一個序列去讀。純苦工。做反應、跑膠、壓片、讀序列,整個再快也要三天,然後 讀出500鹼基對的序列。所以,如果用大腸桿菌來算,460萬個鹼基對,大概需要10,200個定序反應,如果從兩頭一起做,大概需要15,300天才做 得完,也就是要42年~

當然,實際上我們都知道當時是很多實驗室一起做,同時技術也在進步,所以並沒有花那麼久的時間來訂出大腸桿菌的序列。

後來,開始有所謂的自動定序儀,雖然一樣是用雙去氧核糖核苷酸,但是這回這些雙去氧核糖核苷酸上面放了不同顏色的發色基,跑膠的部分則是以毛細管電泳來代替,由於這些雙去氧核糖核苷酸上面帶有不同的顏色(核苷酸只有四種,A腺嘌呤,T胸腺嘧啶,G鳥糞嘌呤,C胞嘧啶),當用雷射刺激的時候會發出不同的色光,然後由偵測器來判讀。讀出來的東西像下圖這樣:

圖片來源:維基百科

由於偵測儀器的敏感度較高,自動定序儀至少可以讀到700個鹼基對,如果遇到技術好的公司,甚至還可以更多。目前大部分實驗室送定序都是用這樣的儀器。但是還是相當耗時費事囉,只是耗時費事的不是學生或博士後研究員,而是廠商。

那第三代是怎麼回事呢?第三代定序完全揚棄了使用雙去氧核糖核苷酸!他們利用DNA進行鏈延長反應時,每併入一個核苷酸會產生一個氫離子(H+),使用晶 片(ISFET, ion-sensitive field-effect transistor)來偵測由於氫離子的產生造成的酸鹼度的改變(下降0.02pH),得知是否有DNA的合成。

要定序的DNA先打碎,接上帶有已知序列的adaptor DNA並固定在直徑為2微米(2μm)的珠子上,然後將珠子放進有晶片的小洞裡。

圖片網址:自然期刊網站

中間那個圖就是一個個小洞,下面是晶片。藉由儀器不斷的重複加入四個核苷酸的溶液(中間當然要洗乾淨),偵測,如果使用有120萬個小洞的晶片,跑兩個鐘頭的反應可以讀出2千5百萬個鹼基對!所以大腸桿菌460萬算什麼呢?當然可能有讀者想,如果兩個鐘頭就可以把大腸桿菌定序完,為什麼上次花了三天呢?事實上定完序列是一件事,但是要把一段段的序列組合、確認、分析,這些部 分才是更花時間的。光把一堆ATGC交出來是沒有用的,要整理要分析才能發揮功用不是嗎?所以上次花了三天其實是包括瞭解這大腸桿菌不簡單,它是一個集各家所長的大腸精,這並不是定序儀可以做到的。定序得那麼快,準確嗎?目前根據研究團隊的分析,準確度比起過去的方法是差不多的,但是光是可以在兩小時內讀出2千5百萬個鹼基對,傳統的定序就遠遠不及 啊!更不用提第一次定人類基因序列時,花了3億美金定完3億個鹼基對(真是字字珠璣),以目前的第三代定序儀,未來想要瞭解你自己,可以先花個1000美 金把自己的基因定序一下,再請電腦分析、分析,或許比什麼血型、星座更準確喔!筆者想到當年當研究生的時候,花了半年的功夫定出一萬個鹼基對(10 kb)的序列,看到現在2小時就可以定2千5百萬個,真覺得自己老了….

資料來源:ScienceNow: A $1000 Genome by 2013? [20 July 2011]

本文原發表於Miscellaneous999

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葉綠舒
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做人一定要讀書(主動學習),將來才會有出息。
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觀賞蝦身上長蟲?俗稱蝦蛭、也不盡然是寄生蟲的蛭蚓

YTLai_96
・2020/12/29 ・3250字 ・閱讀時間約 6 分鐘 ・SR值 530 ・七年級

近年來觀賞蝦養殖興起,連帶的也讓許多人注意到心愛的蝦子身上有時會出現細長的條狀物。對飼主而言,這些像水蛭一樣用前後吸盤交錯黏附移動的不速之客,通常都稱之為「蝦蛭」,而且看那副噁心的長條模樣,勢必就是寄生在蝦子身上造成病狀的禍首,非除之而後快不可。

不過,這些坊間流傳的資訊裡頭其實有些誤會,且讓我們一一道來。

黏在淡水蝦頭上的兩隻蛭蚓。圖/作者提供

那些很像蛭類的小東西

首先,雖然這些細長條狀的蟲像水蛭一樣,用前後吸盤交錯黏附移動,但是牠們其實並不真的屬於蛭類,而是蛭類的親戚,叫做蛭蚓(Branchiobdellidan)。

蛭蚓,顧名思義,就是長相上介於蚯蚓和蛭類的動物。一般而言,蛭蚓的體型微小,身體圓柱狀,僅有數公釐至一公分出頭。雖然蛭蚓和蛭類一樣都是以頭尾交替吸附的方式移動,但蛭類擁有口吸盤和尾吸盤,蛭蚓卻只有尾吸盤而沒有口吸盤。此外,比起擁有 27 節軀幹體節的蛭類,蛭蚓的軀幹體節數僅有 11 節,加上癒合為頭部的 4 節體節也才 15 節。整體而言,似乎像是簡單版的蛭類,因此 21 世紀之前,蛭蚓被視為是較原始的蛭類。

然而,藉著分子親緣技術與工具的進步,本世紀初的研究發現蛭蚓是與蛭類有共祖的姊妹群,而不是原始的蛭類。因此,蛭蚓身上這些看似簡單版的蛭類特徵,應該只是共祖的後代在適應環境的過程中演化的結果。

蛭蚓在解剖顯微鏡下的模樣,左邊為游離搖擺的頭部,右邊則是吸附於表面的尾吸盤。圖/作者提供

蛭蚓或許礙眼,但並不一定是寄生蟲

和蛭類相比,蛭蚓的生活史實在是更不獨立了點。蛭類當中僅有一部份種類不時得附著在其他動物身上吸血營生,但目前已知的所有蛭蚓終其一生都必須附著在其他動物身上,而且絕大多數是以淡水蝦如螯蝦、米蝦為附著的優先選擇,但也有附著於淡水等足目或其他淡水蝦蟹的記錄,因此蛭蚓對於附著的淡水甲殼類種類並沒有強烈的專一性。

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話說回來,蛭蚓雖然整個生活史都要依附在淡水蝦身上,但並不表示牠一定就是對淡水蝦有傷害的寄生蟲。如果蛭蚓的依附讓淡水蝦的生活變得更辛苦,那麼蛭蚓就是對淡水蝦宿主有負面影響的寄生蟲;但如果蛭蚓的依附生活史對淡水蝦不痛不癢,那麼蛭蚓和淡水蝦宿主就是片利共生的關係;而若是蛭蚓的存在讓淡水蝦生活得更好,那麼兩者就是互利共生的關係了。

因此,雖然坊間對蛭蚓在觀賞蝦身上的危害言之鑿鑿,但過去的研究顯示,蛭蚓的食性其實多半是其他更小的無脊椎動物或浮游生物,也會啃食宿主外骨骼上附著的單細胞藻類和其他有機碎屑,況且牠們由兩片硬化的顎構成的口器,實在也不適合啃食宿主的組織或吸食宿主的體液。先前的多數研究也發現,北美洲的蛭蚓待在螯蝦宿主身上,大部分時候既不會提高螯蝦的死亡率,也沒有其他明顯的負面影響,因此蛭蚓和淡水蝦的關係,應該是以對蛭蚓有利、對淡水蝦宿主無害的片利共生為主。

北美螯蝦螯上的蛭蚓。圖/Wikipedia

更進一步而言,蛭蚓依附在淡水蝦身上啃蝕宿主外骨骼黏附的藻類和碎屑,其實可能對宿主是有利的。在一些先前的研究中發現,當蛭蚓在螯蝦宿主身上達到相當密度,則可能因為清理了淡水蝦宿主身上和鰓上沾附的碎屑和藻類,讓宿主變得更身輕如燕而健康,因此蛭蚓和淡水蝦宿主就像是清潔蝦與海鰻一樣,形成了互利共生的雙贏局面。

清潔蝦與海鰻的互利共生關係。圖/Wikipedia

然而,要說蛭蚓在淡水蝦身上一點壞處都不會有,倒也不盡然。近年來的研究發現,當蛭蚓在淡水蝦身上的密度過高,可能就會在吃光了宿主外骨骼上附著的碎屑和藻類之後轉而啃食宿主的鰓組織,因此對宿主造成了負面影響。過高的蛭蚓密度也會限制淡水蝦宿主的移動能力,讓宿主無法正常進食,並且更容易成為捕食者的目標。蛭蚓的胃內含物分析也發現,蛭蚓幼體的消化道中的確有宿主的鰓組織,但蛭蚓成體卻沒有,而且只有棲息在宿主鰓部的蛭蚓,消化道中才會出現宿主的組織。因此,在蛭蚓的生活史中,或許只有早期生活史的幼體階段,而且只有在蛭蚓正好棲息於淡水蝦鰓部的時候,才可能轉以寄生的形式造成宿主負面影響。

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台灣的蛭蚓目前僅一種,而且所知不多

話說回來,上述的研究都是以北美的蛭蚓和螯蝦宿主為研究的對象。在台灣,目前已知的蛭蚓只有平頭霍氏蛭蚓(Holtodrilus truncatus一種,這種蛭蚓廣泛分佈在台灣、日本、韓國與中國,而且多半是在俗稱黑殼蝦的擬多齒米蝦(Caridina pseudodenticulata)、台灣米蝦(Caridina formosae)、白斑米蝦(Caridina leucosticta)、多齒米蝦(Caridina multidentata)、甚至玫瑰蝦(Neocaridina davidi)等的小型淡水蝦身上發現。根據研究,目前僅知分佈於日本本州中部紀伊半島的平頭霍氏蛭蚓的確存在著某些宿主偏好,當兩種不同的淡水蝦同時存在時,會選擇特定一種做為宿主,而且對宿主的選擇偏好也符合在野外觀察到的感染盛行率。至於牠們對宿主的影響是否相似於北美的蛭蚓和螯蝦宿主,也還不得而知,或許因為宿主的相對體型更小,使得台灣的蛭蚓和淡水蝦之間更可能趨近於寄生關係也說不定。

尷尬的是,由於近年來台灣在觀賞淡水蝦市場上輸出了不少淡水蝦個體,連帶的也讓平頭霍氏蛭蚓輸出到世界各國,成了異國水族缸裡的新成員。2020 年的波蘭研究發現,120 隻從台北運到華沙的水族賞玩用的台灣米蝦當中,總共找出了 122 隻附在蝦子身上的平頭霍氏蛭蚓,整體來說這些米蝦感染蛭蚓的比例達 23.3%,感染蛭蚓的米蝦身上平均有 4.4 隻蛭蚓。區分米蝦的性別來看,雄蝦感染蛭蚓的比例似乎稍高,但雌蝦感染的蛭蚓平均數量比較多。平頭霍氏蛭蚓感染的位置也有所偏好,有 44.3% 的感染落在胸足區域,22.1% 的感染在額角附近,其次是 21.3% 的感染在腹足與腹部區域,最後才是 12.3% 的鰓部感染。此外,雖然雌雄米蝦同樣在胸足區域有最多的感染,但雄蝦被蛭蚓感染的位置更常發生在腹足與腹部區域(43.3%),卻不曾出現在額角;反觀雌蝦被蛭蚓感染額角區域有29.3%,在腹足與腹部區域則僅有14.1%。

如何去除平頭霍氏蛭蚓

讓淡水蝦玩家皺眉的消息是,在 2020 年這一篇研究中,雌性台灣米蝦的鰓部、腹足和腹部區域的確可見些許損傷,雖然也可能有其他的原因,但這有可能就是因為平頭霍氏蛭蚓活動造成的。所以,即使蛭蚓可能無害,但對淡水蝦玩家來說,或許是看了討厭、或者是為求保險,總之也許還是希望將蛭蚓除之而後快。那麼,到底該怎麼做才好呢?

其實,去除蛭蚓最簡單的方式,就是將水體鹽度升高到 0.5% 以上。根據 2016 年的日本研究,平頭霍氏蛭蚓在水體鹽度達1%時,三小時內就會死光光,不過這個實驗是把蛭蚓從宿主身上取下來以後才進行的,所以各位淡水蝦玩家們哪天要是想依法炮制,千萬務必先確定手上的淡水蝦能夠忍受鹽度 1% 超過三小時,否則為了去除蛭蚓結果也讓心愛的蝦子魂歸西天,宿主因為附生的無害小蟲而玉石俱焚豈不得不償失,你說是不是哪?

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參考文獻:

Brown BL, Creed RP, Dobson WE (2002) Branchiobdellid annelids and their crayfish hosts: are they engaged in a cleaning symbiosis? Oecologia 132: 250–255

Brown BL, Creed RP, Skelton J, Rollins MA, Farrell KJ (2012) The fine line between mutualism and parasitism: complex effects in a cleaning symbiosis demonstrated by multiple field experiments. Oecologia 170: 199–207

Farrell KJ, Creed RP, Brown BL (2014) Preventing overexploitation in a mutualism: partner regulation in the crayfish–branchiobdellid symbiosis. Oecologia 174: 501–510

Maciaszek R, Jabłońska A, Prati S, Swiderek W (2020) First report of freshwater atyid shrimp, Caridina formosae (Decapoda: Caridea) as a host of ectosymbiotic branchiobdellidan, Holtodrilus truncatus (Annelida, Citellata). Knowledge & Management of Aquatic Ecosystems 421: 33–40

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Niwa N, Archdale MV, Matsuoka T, Kawamoto A, Nishiyama H (2014) Microhabitat distribution and behaviour of Branchiobdellidan Holtodrilus truncatus found on the freshwater shrimp Neocaridina spp. from the Sugo River, Japan. Central European Journal of Biology 9: 80–185

Tanaka K, Wada K, Hamasaki K (2016) Distribution of Holtodrilus truncatus, a Branchiobdellidan Ectosymbiotic on Atyid Shrimps in the Kii Peninsula, Western Japan, with Reference to Salinity Tolerance and Host Preference. Zoological Science, 33: 154–161

大高明史,陳榮宗(2010)台灣內水域新紀錄一種蛭蚓類及四種貧毛類。台灣生物多樣性研究 12: 97–110

大高明史,格爾德,大和茂之,陳榮宗,西野麻知子(2015)台灣匙指蝦類體表兩種外共生蛭蚓目及切頭類之共棲。台灣生物多樣性研究 17: 253–262

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