心臟、尾鰭與脊椎，那些以斑馬魚進行的「再生」研究

本文轉載自顯微觀點

斑馬魚是最知名的模式生物之一，其基因、型態與發育深受了解，並用於探討深度同源等重要演化生物學問題。但也有科學家提出，演化生物學該持續隨環境演進，並嘗試以新的實驗物種——金魚——探討人類世（Anthropocene）環境下的生物演化。

育種歷史與基因巧合 奠定金魚的演化生物學價值

例如有千年馴化歷史、型態千變萬化的金魚，就相當適合探討人類因素與生物型態演化的關聯。

中研院細生所派駐臨海研究站的演化與發育生物學家太田欽也指出，斑馬魚與金魚兩者的胚胎都可以透過顯微鏡仔細觀察，相對於受精一年後才成熟的金魚，斑馬魚有成熟較快，基因組較為單純等優點，也具備許多現成基因研究工具。

但斑馬品系間仍以其生理機能與基因為主要差別，對型態差異的演化並未那麼明顯。因為，科學家為了操作基因與細胞特徵而培育斑馬魚，使不同品系的差異大多來自目標明確的基因工程。

而金魚的型態變異，則完全來自飼養者對型態的偏好和育種，蘊藏更多元的型態變化與發育差異。其悠長的馴養歷史以及更古老的基因重複（Gene Duplication）機遇，使其值得成為演化發育生物學的新模式生物。研究器材和方法上的調整，則是生物學家展現才智的機會。

太田欽也舉例，「一般的解剖顯微鏡工作距離適合觀察和操作斑馬魚，但是經過我們自己的創意，也改裝出可以對金魚進行顯微手術的器具和適合拍攝的大型解剖顯微鏡。設備上的差異並不難克服。」

金魚胚胎的發育生物學優勢

太田欽也說，現代生物學家以果蠅和微生物育種進行遺傳與演化實驗，擴大時間維度來看，千年來金魚愛好者挑選、強化金魚外觀特徵的過程，可以比擬長時間的人擇實驗。

金魚不僅適合用來觀察人擇壓力如何影響成年生物的型態。太田欽也更想進一步探索，從胚胎階段的差異進行選擇，是否可能改變生物的型態。

太田欽也提到，人工育種對發育與型態的影響力也展現在其他物種上，例如家犬與鴿子也被培育出許多特殊表型。但是哺乳動物和鳥類的胚胎觀察不易，需要相當高的技術與成本。

相對於動物子宮與鳥類蛋殼內的胚胎，在透明卵囊中發育的半透明金魚胚胎，就是非常容易觀察的研究對象。只要有恰當的複式顯微鏡、解剖顯微鏡和顯微手術能力，金魚的胚胎從受精到孵化都可以全程順利紀錄，而且每次繁殖可以蒐集到上百筆資料。

自製影片 盼演化生物學跨過學院圍牆

除了將金魚研究成果發表在 Nature 等科學期刊，太田欽也同時努力當起「Youtuber」。他希望能將演化發育生物學、金魚飼育經驗、臨海研究站的學術特色，甚至是宜蘭的風光，透過網路傳達給大眾。

武漢肺炎導致的漫長隔離，是他學習影音製作的契機。最初他在百無聊賴之下看了大量影片，後來逐漸萌發「我也要拍自己的題材！」的企圖心。開始搜尋拍攝、後製、配樂等網路教學，在隔離的單人房中逐漸進步。

太田欽也說，拍攝影片最重要的動機是「分享」。他解釋，「科學的頻道不管累積再多追蹤者，例如數十萬人追蹤的 Nature, Science, 觀眾也以科學領域工作者為主。現代知識逐漸朝向『專家』與『外人』的兩極化狀態發展，我不喜歡這樣的社會。」

如同他推進學術研究的方法，他也透過自學、自己組裝基礎設備如空拍機、手機等，在節省開支的情況下拍出了中研院同僚為之驚艷的影片。

在早已開始的人類世 何謂自然？

太田欽也熱衷以空拍影片介紹宜蘭的郊野與人文，但他對主流輿論的「自然環境」內涵存疑，他認為「自然」早已被人類行為大幅改變。自從農業擴張、工業革命發生，人類對環境與生物的改變程度早已無法恢復「自然原貌」。

他以金魚的馴化過程為例，從宋朝開始的愛好者，透過育種極力凸顯特殊形態，從沒有背鰭的「蛋種」，到眼周水泡足以遮蔽視線的「水泡眼」。都不是基於適應「自然」而進行的育種。

太田欽也強調，「如果是宋朝或明朝人有今天的生物學工具，以他們的追求珍奇的育種態度，一定會用 CRISPR 編輯金魚基因，製造出更奇特的變異型態。」

他說，這樣的行為會在現代科學圈與社會輿論上遭到反對，「認為動物被修改基因、型態變異很可憐」，但人類採用動物進行藥物實驗或經濟用途時，也並未優先考慮「自然原則」。

太田欽也反問，「若是透過基因編輯技術將金魚修改回類似野生鯽魚的型態，更適應野外環境，這樣算是自然或不自然呢？」

建立科技倫理 而非堅守「自然」想像

他指出，金魚的馴化與育種反映著東亞社會的自然觀念，不同於西方基督教倫理的「人統御、保護自然」意識形態。可以促進人們反思，人類也身在其中的「自然」的標準是什麼？而非執著於保護想像中的自然「原狀」。

太田欽也強調，「本質化『自然』、建構一個保守不變的形象，不會幫助人們了解生物學。」

他認為，宋朝人、明朝人的自然觀念與今日不同；甚至現代人常引用的「道法自然」倡議者老子，他所提倡的自然，與現代許多人想像、意圖恢復的也是不同的自然。

太田欽也建言，科學地面對人類因素影響世界各地生態的現實、建立基因科技的社會倫理與規範，都是比恢復建構出的「自然」意象更重要的生物學議題。

來自日本和歌山縣鄉間的太田欽也說，長期駐守宜蘭頭城的臨海研究站不僅是因為設施與職位，也是因為此處環境與故鄉有幾分神似。

「但我不會說這兩個地方都很『自然』，在人們對我說『這裡很自然！』的時候。」太田欽也無奈地笑說，「想到周遭可以釣起吳郭魚的溪流、被整治疏濬成田園的原洪氾濕地，反而會讓我很疑惑彼此對『自然』的共識。」

1995 年諾貝爾化學獎得主克魯岑（Paul Crutzen）指出，現代已是由人類行為影響地質特性的人類世。此概念引起地質科學界激烈討論，從新石器時代、工業革命到核彈試爆頻繁的 1960 年代都有學者認為是人類世的開端。

最後由國際地層委員會的人類世工作小組投票決定，視第二次世界大戰後、人口與人類活動高速成長的20世紀中葉為人類世起點。

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參考資料

1. Li IJ, Lee SH, Abe G, Ota KG. Embryonic and postembryonic development of the ornamental twin-tail goldfish. Dev Dyn. 2019 Apr;248(4):251-283.
2. Abe G, Lee SH, Chang M, Liu SC, Tsai HY, Ota KG. The origin of the bifurcated axial skeletal system in the twin-tail goldfish. Nat Commun. 2014 Feb 25;5:3360.
3. 太田欽也實驗室

本文轉載自顯微觀點

乍看以為是寶石結晶的斑馬魚肌纖維、如竹林屏風般的斑馬魚尾鰭，到似貓頭鷹的斑馬魚鏡像圖以及充滿生命力大樹般的斑馬魚神經樹突，每一幅影像都以斑馬魚為題，卻拍出不同的趣味。

本次 Taiwan 顯微攝影競賽八名優選獎中，就有四位得獎者是中研院細胞與個體生物學研究所陳振輝老師的學生。這些拍出技術與美感兼具作品的研究者，分別為 Uday Kumar、Marco De Leon、陳樂融和劉昱秀。

其中， 來自印度的 Uday Kumar 參加第一屆顯微攝影競賽至今，年年獲獎，更榮獲首屆金獎。而他的同儕，來自菲律賓的 Marco De Leon 也因受到他的啟發參賽，於今年獲得優選。

陳振輝老師實驗室主要以斑馬魚為樣本進行再生研究。他的學生們各自探索斑馬魚的不同組織或器官；有人專精於研究心臟、有人專門研究神經，有人則專門研究肌肉纖維。

Uday Kumar 表示，由於每個人研究的方向不同，因此必須從基因工程到成長過程，各自「顧好」自己的斑馬魚。

這些攸關研究進度與實驗設計的斑馬魚，養殖在細生所地下室的魚房。數十個排列整齊畫一的魚缸，裡頭有著各式大小、不同生長階段和品系的斑馬魚。

為了能夠取卵進行基因轉殖，從養殖器皿到時間都必須加以控制。Uday Kumar 表示，除了一般魚缸外，養殖斑馬魚會再裝置一個多孔的產卵盒。晚上將公魚和母魚用隔板隔開，並保持環境黑暗，避免交配產卵。

等到隔天上午將隔板拿掉，讓公魚、母魚相會，並利用光周期誘發產卵、受精後，必須將特製的產卵盒斜置，好讓受精卵下沉到魚缸底部。如此一來，也可避免斑馬魚將受精卵吃掉。

陳振輝老師實驗室專注於「多顏色細胞標誌技術」（Brainbow/Skinbow）。利用基因重組的方式，將紅、藍、綠三種不同色的螢光蛋白在個別細胞裡表現不同數量，依不同比例產生更多顏色來標誌不同細胞。

Uday Kumar 表示，要將目標基因注入細胞內，需要使用顯微注射技術，在立體顯微鏡下將注射管準確地插入受精卵中。

不過這對他來說，顯微注射已經是一件熟練到「像騎腳踏車」般簡單的事，一天注射超過 500 顆受精卵都沒問題。

雖然基因轉殖對這些研究者來說已是熟能生巧的事，但要建立新的基因轉殖魚仍然要花上漫長的時間，通常需要 6 個月到一年，品系才會逐漸穩定。以 Uday Kumar 於 2021 年獲得金獎的作品來說，就是花了兩年才培育出能以正確比例呈現美麗色彩的斑馬魚。

顯微攝影的每一幅作品除了呈現出精彩美麗的影像外，背後更蘊含著每一位研究者精湛的技術以及長久累積的研究心血。

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參考資料

1. 顯微鏡下一抹彩虹，陳振輝，《中央研究院週報》第 1610 期
2. 臺灣斑馬魚中心——中研院分支介紹，黃聲蘋，《中央研究院週報》第 1360 期
3. 心臟、尾鰭與脊椎，那些以斑馬魚進行的「再生」研究
4. 「從動物身上問對問題，就可以找到答案！」陳振輝談斑馬魚的超強再生力

本文轉載自中央研究院研之有物，泛科學為宣傳推廣執行單位。

• 採訪撰文／寒波
• 責任編輯／簡克志
• 美術設計／蔡宛潔

不用合成新 DNA 的細胞分裂——無合成分裂

細胞分裂，想來是再簡單不過的事情：一顆細胞先將遺傳物質複製為兩份，再一分為二，分配給兩顆細胞。然而，由中央研究院細胞與個體生物學研究所的陳振輝助研究員領軍，2022 年 4 月發表在《自然》（Nature）的論文，卻報告了過往未知的一種分裂方式：斑馬魚的皮膚細胞，可以直接一變二，再二變四，過程中不用合成新的 DNA！這項未來將改寫教科書的新知識，當初是如何發現、驗證，未來又有什麼衍生方向呢？中研院「研之有物」專訪陳振輝助研究員，請他和我們仔細分享斑馬魚的「表面功夫」。

將顏色植入斑馬魚的每一個細胞

陳振輝實驗室的研究大多著重於「再生生物學」，新研究算是「發育生物學」的領域。不過了解背後細胞行為調控的機制就會知道，這兩個領域其實是共通的。

陳振輝以斑馬魚作為實驗材料，基因改造後讓不同細胞被標記上不同顏色，使得不同細胞的動態行為，能夠被清晰地分辨和追蹤。這個研究方法可以用來探究逆境下複雜組織的再生，也能用來研究正常狀況下動物的發育進程，因為這些過程都涉及大量細胞的動態調控。

發育生物學是生物學研究的熱門領域，投入者眾，大部分的研究者都針對部分細胞或特定基因作探討，陳振輝團隊的技術讓他們能同時追蹤單一活體動物整個組織裡所有的細胞。這項技術除了用在皮膚組織（方法名為「palmskin」），陳振輝也用類似的方法探索肌肉、肝臟等各式器官的發育、再生過程。

創造色彩繽紛的細胞，原理其實很簡單，就是利用紅色、藍色、綠色的三原色不同比例的組合。具體作法是透過基因改造，將能製造紅、藍、綠色螢光蛋白質的基因組，植入斑馬魚的細胞，利用遺傳學的工具，讓表皮、肌肉、肝臟等目標組織的每一顆細胞，隨機表現出不同的顏色組合。

舉例來說，其中一個細胞可以表現「3 個紅色螢光蛋白 + 5 個藍色螢光蛋白 + 4 個綠色螢光蛋白」，隔壁細胞可能是「1 紅 + 2 藍 + 6 綠」，鄰近細胞間便能呈現不同顏色，讓長期追蹤所有不同細胞成為可能。

將調色盤植入細胞的原理看似簡單，做起來卻要耗費不少功夫，尋找適合的基因轉殖魚需要半年到一年的時間。陳振輝解釋用斑馬魚當實驗材料的優點：它們容易繁殖，生長的週期不用等太久，體積小，容易操作；更重要的是魚體扁平，容易拍攝大面積、高解析度的細胞影像，進行系統性的量化分析。搭配讓每一顆細胞，從誕生到凋逝都無所遁形的全面「監控」影像平台，才有機會觀察到前人視而不見的細胞分裂方式。

隱藏在「表面之中」的無合成分裂

斑馬魚的皮膚和人類的皮膚基本構造類似。唯一不同是人類的皮膚有角質層覆蓋，斑馬魚皮膚的外層是沒有角質化的活細胞，適合拍照觀察。斑馬魚的另一優點是在顯微鏡下活體觀察時不會傷害到魚體，麻醉後可以直接拍照，再放回水中喚醒；如此才能追蹤同一條魚從出生到長大，身上所有皮膚細胞的動態行為。

研究斑馬魚的學者很多，皮膚發育這回事可謂天天在人們的眼前發生，可是其它人為什麼都視而不見，沒有注意到陳振輝團隊發現的無合成分裂呢？事情其實沒有說起來那麼簡單。

斑馬魚的皮膚分為上中下三層，下層的幹細胞，會分裂產生新的細胞，送到上層成為覆蓋身體最外側的皮膚細胞。其它研究人員如果見到表皮細胞的數目變多，直觀的想法會是下層的幹細胞又送上新的細胞，不會想到是上層既有已分化的細胞可以直接進行分裂。

陳振輝表示，一開始見到表皮細胞的數量增加時，直覺也認為是下層幹細胞產生的新細胞，可是連續追蹤後卻發現不是這麼回事。由於他的技術可以對斑馬魚身上 2,000 到 3,000 顆皮膚細胞進行同時監測，才意外察覺到上層已分化的細胞竟然會不用複製遺傳物質，就直接分裂成兩顆，甚至是四顆細胞！

顛覆認知：不用合成 DNA 的細胞分裂

外行人聽起來好像沒什麼，上述發現其實開拓了細胞分裂研究的新領域。精子和卵子這類生殖細胞（germline cell），在複製遺傳物質以後會經過 2 次分裂，形成 4 顆細胞，也就是減數分裂（meiosis）。構成身體的體細胞（somatic cell）則會先複製內部的遺傳物質，再分裂 1 次成兩顆細胞，稱為有絲分裂（mitosis）。

還有較少見的狀況，如 DNA 複製後細胞不分裂，變成多套遺傳物質的 1 顆細胞（endoreplication）；或是多個細胞融合在一起，成為 1 顆多核細胞（cell-cell fusion，例如骨骼肌細胞）。

然而不管怎麼分裂，過去研究沒有發現不用複製 DNA 就能分裂的細胞！正常細胞分裂的過程有許多監控機制，如果細胞的遺傳物質沒有完整複製，一般情況細胞應該會啟動相關的監控機制，阻止分裂過程的進行。癌症細胞不受控制的分裂，就是相關機制沒有正常運作。

斑馬魚表皮細胞竟然能在沒有複製遺傳物質的情況下，避免細胞凋亡的命運，持續分裂，是一個很特別的例外。

論文投稿到《自然》期刊後，四位同儕審查者一致給予正面評價，但是顛覆認知的新發現仍受到不少質疑，需要陳振輝團隊進行許多額外的實驗來回答。

有沒有觀察失誤的可能？

陳振輝團隊同時標記下層、上層的細胞，證實進行分裂的細胞確實位於上層。為了證明遺傳物質沒有複製，他們進一步測量細胞內 DNA 的量，包覆 DNA 的組蛋白（histone）的量，以及施加阻止 DNA 複製的藥劑。

結果顯示分裂後的細胞，遺傳物質的含量確實有等比下降，分裂過程不受阻止 DNA 複製藥劑的影響。顯然細胞沒有合成新的 DNA 就直接分開，陳振輝稱之為「無合成分裂」（asynthetic fission）。

所以，究竟是怎麼分裂的？

顯微鏡下看來似乎沒有一定的章法，有些表皮細胞會分裂 2 次成 4 顆細胞，有些分裂 1 次成 2 顆細胞，還有些不會分裂，維持 1 顆細胞；也發現有少數細胞可以逆轉分裂過程，形成雙核細胞。

陳振輝團隊現有的研究技術，尚無法辨明胞器的分配，以及每一條染色體的分配模式；團隊預計使用單細胞定序（single cell DNA sequencing），在無合成分裂後，分別定序每一顆細胞分配到的染色體組成，以釐清細胞的遺傳物質是否有特定的拆分方式。

一切都是為了節省資源！努力長大的表皮細胞

無合成分裂對斑馬魚有什麼意義呢？斑馬魚由受精卵孵化後，仔魚在前 8 天不用吃東西，成長速度緩慢；第 8 天起開始進食，體型也像吹氣球般迅速膨脹，第 14 天時成長速度達到最快。觀察發現從第 8 天 到 21 天，皮膚細胞會發生無合成分裂，團隊推測此一分裂現象與身體表面積的快速延展息息相關。

僅管省略掉複製遺傳物質的階段，細胞進行無合成分裂所花費的時間，卻比一般細胞分裂稍慢，所以其優點並非單純的縮短時間，應該是節省資源。斑馬魚仔魚身體的表面積在特定時間迅速增加，體表需要皮膚細胞的完整覆蓋，團隊發現細胞進行 1 次無合成分裂，表面積能增加 26%，兩次能達到 59%，這些細胞能在斑馬魚體表存活 2 到 3 週的時間。

斑馬魚如何啟動無合成分裂呢？目前仍不太清楚，團隊發現其過程受到表面張力變化的影響。皮膚細胞有感應張力變化的特定離子通道，利用藥物影響這些離子通道的活性，無合成分裂也會受到影響，詳細作用機制仍有待更多的研究。

生活數量的密度也會影響斑馬魚長大？

另一項十分有趣的發現是，無合成分裂和仔魚生活的密度有關。斑馬魚從仔魚長到成體，最終的體型都差不多，但是生長過程則有很大的差異，個體成長速度有快有慢。假如將許多仔魚養在一起，處於高密度的生活環境，個別仔魚的生長速度會較慢。

奇妙的是，一旦換到低密度的環境，仔魚的成長速度會瞬間暴增，體表面積快速增加又要維持皮膚細胞的完整覆蓋，會導致更多的無合成分裂。斑馬魚如何感知、在生理上反應周遭環境鄰居密度的變化，是另一個有趣的研究方向。

進行無合成分裂的細胞缺乏完整的遺傳物質，還能算是有生命的活細胞嗎？陳振輝提醒我們，多細胞生物的生理機能由各式各樣的細胞一起維持，某些特化的細胞還沒有細胞核。例如紅血球的成熟會經過脫核的過程，完全沒有細胞核的紅血球有重要的生理功能也可以存活超過 100 天。在斑馬魚體表進行無合成分裂的皮膚細胞，或許也有它們短暫卻不可或缺的使命。

有可能其它生物的細胞也會無合成分裂嗎？

無合成分裂目前只在斑馬魚表皮的發育過程中觀察到，其它細胞、其它生物、其它情境下是否也存在呢？事實上陳振輝自己也很好奇。

以人體來舉例，體表的皮膚，口腔內膜、消化道組織，時時刻刻都需要大量的表皮細胞覆蓋，而且耗損甚鉅，有不斷補充的需求。這些必須持續維持完整覆蓋表面的情境，或許無合成分裂也參與在其中。

然而，無合成分裂不容易在活體動物直接觀察。例如小鼠的模式，就算能引進三原色調色盤的細胞標誌技術，也不像斑馬魚仔魚那般透明容易拍照。話說回來，知道某個現象有可能發生，就是發現的第一步。假如其它細胞或是生物也存在無合成分裂，在陳振輝團隊邁出第一步以後，未來一定有人能克服相關的技術門檻來進行研究。

發現斑馬魚表皮細胞的無合成分裂，像是開啟一扇新的大門，可以通往過去想像不到的研究方向。會有醫學應用的可能嗎？像癌症是細胞的不正常分裂，任何細胞分裂機制的基礎研究，應該有機會對癌症的治療有所啟發。陳振輝同意這是潛在的研究方向之一，但是他也強調從基礎研究到醫學應用，是很漫長的一段路，科學家能做的就是一步一步踏實前進。

對沒預期的發現保持警覺，在探索過程中充分滿足自己的好奇心，將支持陳振輝持續前進，挑戰下一個研究課題。