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左看右看 貓頭鷹、寶石竟是斑馬魚

顯微觀點_96
・2024/03/28 ・1867字 ・閱讀時間約 3 分鐘

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本文轉載自顯微觀點

乍看以為是寶石結晶的斑馬魚肌纖維、如竹林屏風般的斑馬魚尾鰭,到似貓頭鷹的斑馬魚鏡像圖以及充滿生命力大樹般的斑馬魚神經樹突,每一幅影像都以斑馬魚為題,卻拍出不同的趣味。

本次 Taiwan 顯微攝影競賽八名優選獎中,就有四位得獎者是中研院細胞與個體生物學研究所陳振輝老師的學生。這些拍出技術與美感兼具作品的研究者,分別為 Uday Kumar、Marco De Leon、陳樂融和劉昱秀。

其中, 來自印度的 Uday Kumar 參加第一屆顯微攝影競賽至今,年年獲獎,更榮獲首屆金獎。而他的同儕,來自菲律賓的 Marco De Leon 也因受到他的啟發參賽,於今年獲得優選。

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陳振輝老師實驗室主要以斑馬魚為樣本進行再生研究。他的學生們各自探索斑馬魚的不同組織或器官;有人專精於研究心臟、有人專門研究神經,有人則專門研究肌肉纖維。

Gems And Maturity Marco Pomida De Leon
Gems And Maturity Marco Pomida De Leon
生命之樹 劉昱秀

Uday Kumar 表示,由於每個人研究的方向不同,因此必須從基因工程到成長過程,各自「顧好」自己的斑馬魚。

這些攸關研究進度與實驗設計的斑馬魚,養殖在細生所地下室的魚房。數十個排列整齊畫一的魚缸,裡頭有著各式大小、不同生長階段和品系的斑馬魚。

為了能夠取卵進行基因轉殖,從養殖器皿到時間都必須加以控制。Uday Kumar 表示,除了一般魚缸外,養殖斑馬魚會再裝置一個多孔的產卵盒。晚上將公魚和母魚用隔板隔開,並保持環境黑暗,避免交配產卵。

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等到隔天上午將隔板拿掉,讓公魚、母魚相會,並利用光周期誘發產卵、受精後,必須將特製的產卵盒斜置,好讓受精卵下沉到魚缸底部。如此一來,也可避免斑馬魚將受精卵吃掉。

陳振輝老師實驗室專注於「多顏色細胞標誌技術」(Brainbow/Skinbow)。利用基因重組的方式,將紅、藍、綠三種不同色的螢光蛋白在個別細胞裡表現不同數量,依不同比例產生更多顏色來標誌不同細胞。

Uday Kumar 表示,要將目標基因注入細胞內,需要使用顯微注射技術,在立體顯微鏡下將注射管準確地插入受精卵中。

不過這對他來說,顯微注射已經是一件熟練到「像騎腳踏車」般簡單的事,一天注射超過 500 顆受精卵都沒問題。

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雖然基因轉殖對這些研究者來說已是熟能生巧的事,但要建立新的基因轉殖魚仍然要花上漫長的時間,通常需要 6 個月到一年,品系才會逐漸穩定。以 Uday Kumar 於 2021 年獲得金獎的作品來說,就是花了兩年才培育出能以正確比例呈現美麗色彩的斑馬魚。

顯微攝影的每一幅作品除了呈現出精彩美麗的影像外,背後更蘊含著每一位研究者精湛的技術以及長久累積的研究心血。

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細生所地下室的魚房,有著各式大小、不同生長階段和品系的斑馬魚。攝影/楊雅棠
Uday Kumar使用立體顯微鏡。攝影/楊雅棠

斑馬魚小教室

斑馬魚(Danio rerio)是常見的模式生物之一,原分布於孟加拉、印度、巴基斯坦、緬甸、尼泊爾等南亞淡水流域。其體長約 3 至 4 公分,雄魚體修長且背部呈淺橄欖黃色,雌魚體渾圓腹部較彭大;適合生長溫度為 23 至 28℃。

斑馬魚胚胎透明、發育期間短,容易觀察;且屬於脊椎動物,與人類有相似器官如心血管、神經等,加上基因組序列已解開,基因轉殖容易,種種優點使得牠成為非常適合作為遺傳研究及藥物篩選的脊椎動物模式。

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參考資料

  1. 顯微鏡下一抹彩虹,陳振輝,《中央研究院週報》第 1610 期
  2. 臺灣斑馬魚中心——中研院分支介紹,黃聲蘋,《中央研究院週報》第 1360 期
  3. 心臟、尾鰭與脊椎,那些以斑馬魚進行的「再生」研究
  4. 「從動物身上問對問題,就可以找到答案!」陳振輝談斑馬魚的超強再生力
文章難易度

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顯微觀點_96
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從細微的事物出發,關注微觀世界的一切,對肉眼所不能見的事物充滿好奇,發掘蘊藏在微觀影像之下的故事。

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筆耕卅五載,洞鑒電路板春秋——專訪PCB切片權威白蓉生
顯微觀點_96
・2024/03/30 ・4463字 ・閱讀時間約 9 分鐘

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本文轉載自顯微觀點

低調的電子產品之母

拆開任何現代電子產品,都可以發現印刷電路板(Printed Circuit Board, PCB)的踪影。從地球外的人造衛星、最新款 iPhone 到傳統桌上型電話,印刷電路板都在其中乘載元件、傳遞訊號,因此也被稱為「電子產品之母」。

臺灣是舉世聞名的 PCB 出口大國,儘管出現廠商逐廉價勞動力外移的趨勢,臺灣企業的市占率依然超過三成,位居全球第一。

在追求精密化、提高良率的產業進步過程中,分析 PCB 切片顯微影像是不可或缺的步驟。要看得細膩真確,則有賴 PCB 樣本製備及影像判讀,兩項需要精密操作、耐心和敏銳判斷力的技術。

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從拋光臺到編輯臺

現年 85 歲的白蓉生,是兩岸 PCB 業界備受尊敬的分析技術權威,曾獨立經營《電路板資訊雜誌》8 年,並擔任臺灣電路板協會《電路板季刊》總編輯 25 年。他磨練 PCB 切片檢驗與判讀能力 40 餘年,持續對業界分享他的獨門 PCB 顯微分析心得。

影像來源:顯微觀點

自 1980 年代以來,白蓉生公開發表超過 800 篇圖文並茂的 PCB 檢測技術文章,並擔任國內外重要廠商的技術顧問。他不藏私的經驗分享,促成 PCB 製造商的技術躍進與營業成長。

PCB 檢測過程中,光學顯微檢驗是最為基礎,也提供最多資訊的步驟。進入顯微載物台之前,PCB 需要經過切片取樣、封膠、研磨、拋光、微蝕等步驟。其中切片與研磨、拋光需要格外細緻的操作能力,才能在顯微鏡下呈現清晰平整的切面。

良好的 PCB 切片樣本,可以將整個切面維持在同一個焦平面,均勻呈現孔道的鍍銅品質、不同金屬間介面的良窳,整個水平面上的顯微景觀都維持清晰對焦。透過尋找細微瑕疵,來改進 PCB 的製造過程。

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「在放大 1000 倍、3000 倍後,都可以維持切面對焦的樣本,才是合格的切片樣本。」

—在每一篇技術文章都分享數十張顯微影像的白蓉生如此強調。
平焦與起伏對比切片小圖20231013163621
圖 1 與圖 2 是常見 QA 等級的切片,同一個視野中就出現失焦。圖 3 與圖 4 則整個視野都能清晰成像,符合白蓉生要求的 FA 切片標準。影像來源:白蓉生

精細樣本製備與多重顯微技巧

白蓉生以業界檢驗分級 QC(Quality Control, 品質管理), QA(Quality Assurance, 品質保證), FA(Failure Analysis,故障分析)為案例,「合格的 FA,追求整個切片視野的焦聚一致,一覽無遺。一般 QC 或 QA 人員,慣於接受觀察球面樣品,對於看不清楚的部分不了了之。」

他指出,業界常見的球面切片無法得到清晰的全面影像,是研磨與拋光的技術與耐心不足。焦點起伏不定的切面無法展現細節中的魔鬼,工程師自然也無法精進製程、更換材料以祛除瑕疵,。

現任職欣興電子技術顧問的白蓉生,在廠內建立 FA 切片師的培訓與考試機制,30 年來僅有 20 多人合格。製備合格切片之後,影像判讀是分析製程的必須能力,因此白蓉生設立與 FA 切片師並行的 FA 判讀師制度,迄今也只有 20 多人合格。

白蓉生感嘆,「切片與判讀都需要下苦功練習,30 年來只有 3 個人獲得切片師與判讀師雙料合格。」

—來向他學習切片與判讀技術的,往往是 PCB 業界的資深工匠或管理階級,要放下既有經驗與身段並不容易。

白蓉生笑說,「來學切片判讀的,常常是經理或副理,對專業經驗自視甚高。但他們所學愈深,就愈是謙遜。登堂入室,才發現前方學海無涯。」

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白蓉生善用多種顯微技巧,樣本中的細微差異都無法逃脫他的法眼。影像來源:白蓉生

隨著顯微技術演進,業界流行使用電子顯微鏡觀察切片,認為看愈小愈好。白蓉生卻堅持以光學顯微影像作為判讀依據。因為在電子顯微鏡下,只有黑白影像,無法利用顏色分辨不同材質。

白蓉生說「用電顯判讀的結果,無法分析顏色。我認為都是胡說,像是文盲在看書。儘管能看到很小的顆粒,分析人員也只能看著黑白影像說:『那是雜質』。」

切換明視野、暗視野、偏光干涉等光學技術,再搭配透視與立體顯微鏡的組合,PCB 切片中不同金屬在白蓉生鏡下呈現明顯對比,相同金屬也會因為歷經不同處理而呈現不同顏色。電鍍銅與化學銅的差異、電鍍與焊接的品質,都在白蓉生的顯微影像中一覽無遺。

領導業界規格 畢生追求精進

除了基本的明場自然光,白蓉生也分享他常用的顯微技巧:以明場光源搭配干涉,在最暗與最亮的偏光下可獲得透視效果。明場兼用偏光與干涉可以使銅面呈現立體效果,且電鍍銅會呈現藍色易於分辨。採用偏光與干涉的單純暗場則能呈現最佳的材質對比效果。

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白蓉生強調,「因為能看出金屬介面的細緻型態,我們才能知道技術要如何改進。」

—「而不是把顆粒都標籤為『異物』,說服自己製程、材料很完美,失去進步的機會。」

在白蓉生指引的工藝改革下,原本表現平庸的欣興電子成為精密載板的重要國際供應商。他得意地說,「我們製作的 Daisy Chain 載板佈線連貫強韌,承受 500 次熱漲冷縮測試之後,電阻增加不到 5%。技術紮實到連 Nvidia 這種頂級客戶都大吃一驚。」

欣興電子雇用白蓉生為顧問後,他追求精進的態度製程水準帶來革命般的改變。白蓉生回憶,早先欣興電子的產品良率不到八成,「或許剛好可以維持公司運作,但也無利可圖。」

現在欣興電子的高階 IC 載板良率已穩定超過 9 成 5,股價也成長超過十倍。白蓉生笑說,「我沒有因為公司股票賺錢!我原本就不想要賺大錢,因為錢多了沒用,只是徒增煩惱。」

電鍍銅細微變形
電動車用的 5G 通訊電路板,在 50 次回焊之後必須維持電阻值變化在 5% 之內。圖中的細小變形就會導致電阻值增加。影像來源:白蓉生
電鍍銅在50次回焊後軟化變形
電路板回焊 50 次後,電鍍銅軟化變形,可能導致電阻增加。業界進行品質管控時經常忽略這種細節。需要細緻的顯微觀察技術才能發現。影像來源:白蓉生

以紙上技藝傳遞電路板工藝

話雖如此,白蓉生也坦承,「當年創立《電路板資訊雜誌》是生活所需,因為從安培離職,沒工作就沒收入啦!」

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從資深工程師轉為科技月刊發行人兼總編輯,白蓉生的生活更加忙碌,全副精神都浸泡在 PCB 技術知識的研讀和傳遞中。

他回憶,當時他自己擔任總編輯兼送報生,手稿交由妻子與另一位打字員處理,在沒有網路的時代,每一期要繳出 5 萬字圖文並茂的稿子。除了努力訪問國內廠商、專家,也要大量編譯國外刊物內容。當年雜誌收入以廣告費為主,每個月可以得到超過 20 份廣告委託,在沒有前例的科技月刊市場上,開拓出意外佳績。

《電路板資訊雜誌》從 1988 年發行至 1996 年,白蓉生在 8 年間自力編譯、採訪、寫作,從早晨六點到午夜睡前,都在蒐集資料、勤奮筆耕。

「我一周六天都在編雜誌,沒有應酬娛樂,也沒請過病假,因為連生病的時間都沒有!」

—月刊生涯的辛勤讓白蓉生難以忘懷。

雜誌停刊之後,白蓉生享受了兩年退休生活,發現自己閒得發慌。他受邀擔任臺灣電路板協會(Taiwan Printed Circuit Association, TPCA)的顧問及《電路板季刊》總編輯,繼續研究、傳授電路板顯微影像的判讀方法,以及細緻的製程改善技巧。

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白蓉生老師 小圖

《電路板季刊》迄今已發行 100 期,白蓉生也成為華語世界最重要的電路板知識傳遞者。

懷有珍貴 PCB 分析知識與技術的白蓉生,在兩岸業界深受重視,是各大廠商極力邀請的講師。他的判斷力不是來自學校或公司的教育體系,而是靠著多年來的勤奮自學。

好學、勤奮與謙虛的自我養成

白蓉生說,他少時家貧,因此就讀師範學校以省下學費,還能領錢和白米幫助家境。但師範學校學歷不如一般大學(當時師範學校專門培育小學校教師,僅需 3 年教育),心有不甘的白蓉生在小學任教三年後,考上中興大學化學系,同時擔任小學老師和大學生。

白蓉生在大學畢業後進入中華航空擔任化學工程師,反覆的電鍍工作並未帶給他成就感,他於是轉職美商安培電子(Ampex)。1969 年起,白蓉生在安培電子大量接觸 PCB 製造與檢測的第一線作業,開啟了鑽研 PCB 分析判讀的專業道路。

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1969 年,安培電子於桃園設廠,是臺灣 PCB 生產王國的發軔時刻。白蓉生在此接觸到國內最先進的 PCB 工藝。他樂於在下班之後繼續研究檢測材料,探索各種慣例外的顯微方法,逐步建立自己的 PCB 切片檢查技巧。

手動拋光使刮痕消失
樣品拋光也是白蓉生長年執著而深入的技術。他對學生一概要求手動拋光,以免電動轉盤拋光機的力量導致表面起伏不平。他強調,要用衣物布料等級的棉質針織布輕柔拋光,才能得到平坦無刮痕的樣品。影像來源:白蓉生

除了 PCB 製造工藝的獨到見解,對文學的喜愛也是白蓉生筆耕不輟的動力來源。他說,自己求學時力求節儉,一直步行上學,超過 40 分鐘的漫漫路途是他背誦古文的時間,對文學的興趣、寫作的欲望隨著路程逐漸滋長。

對於中年轉行,成立沒有前例可循的專業技術雜誌,白蓉生笑稱,「當初發行頭幾期雜誌就燒完 6 萬塊積蓄,我還真不知道能不能回本。」

從技術專家、顧問到專業刊物總編輯,白蓉生拓展並傳承 PCB 分析工藝將近半世紀。他至今保持30年前「永晝方塊每隨飯,長夜蟹文伴枕眠」的強韌動力,投入 PCB 檢測、寫作與講課,建構低調踏實的臺灣電路板工藝文化。

他認為,電子產業是臺灣立國基礎,業界訓練可以彌補產學落差,但好學、勤奮與謙虛的心態是學校或企業不能代勞的,得要由年輕世代主動保持。端正的學習心態結合不藏私的深入技術指導,能養成更多專業人才,使電路板工藝精進,提升業界整體價值。

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一切都為了快快長大!斑馬魚的「無合成分裂」,「表面」到你難以察覺
研之有物│中央研究院_96
・2022/10/08 ・5419字 ・閱讀時間約 11 分鐘

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本文轉載自中央研究院研之有物,泛科學為宣傳推廣執行單位。

  • 採訪撰文/寒波
  • 責任編輯/簡克志
  • 美術設計/蔡宛潔

不用合成新 DNA 的細胞分裂——無合成分裂

細胞分裂,想來是再簡單不過的事情:一顆細胞先將遺傳物質複製為兩份,再一分為二,分配給兩顆細胞。然而,由中央研究院細胞與個體生物學研究所的陳振輝助研究員領軍,2022 年 4 月發表在《自然》(Nature)的論文,卻報告了過往未知的一種分裂方式:斑馬魚的皮膚細胞,可以直接一變二,再二變四,過程中不用合成新的 DNA!這項未來將改寫教科書的新知識,當初是如何發現、驗證,未來又有什麼衍生方向呢?中研院「研之有物」專訪陳振輝助研究員,請他和我們仔細分享斑馬魚的「表面功夫」。

陳振輝研究團隊發現斑馬魚表皮細胞有「無合成分裂」現象,研究成果於 2022 年 4 月發表在國際頂級期刊《自然》。圖為陳振輝(右)與第一作者陳潔盈(左)合影。圖/研之有物

將顏色植入斑馬魚的每一個細胞

陳振輝實驗室的研究大多著重於「再生生物學」,新研究算是「發育生物學」的領域。不過了解背後細胞行為調控的機制就會知道,這兩個領域其實是共通的。

陳振輝以斑馬魚作為實驗材料,基因改造後讓不同細胞被標記上不同顏色,使得不同細胞的動態行為,能夠被清晰地分辨和追蹤。這個研究方法可以用來探究逆境下複雜組織的再生,也能用來研究正常狀況下動物的發育進程,因為這些過程都涉及大量細胞的動態調控。

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陳振輝以斑馬魚作為實驗材料,基因改造後讓不同細胞被標記上不同顏色,使得不同細胞的動態行為,能夠被清晰地分辨和追蹤。圖片這隻為斑馬魚的仔魚,年齡為受精之後第 8 天。(另開圖片可放大檢視)圖/陳潔盈、陳振輝

發育生物學是生物學研究的熱門領域,投入者眾,大部分的研究者都針對部分細胞或特定基因作探討,陳振輝團隊的技術讓他們能同時追蹤單一活體動物整個組織裡所有的細胞。這項技術除了用在皮膚組織(方法名為「palmskin」),陳振輝也用類似的方法探索肌肉、肝臟等各式器官的發育、再生過程。

創造色彩繽紛的細胞,原理其實很簡單,就是利用紅色、藍色、綠色的三原色不同比例的組合。具體作法是透過基因改造,將能製造紅、藍、綠色螢光蛋白質的基因組,植入斑馬魚的細胞,利用遺傳學的工具,讓表皮、肌肉、肝臟等目標組織的每一顆細胞,隨機表現出不同的顏色組合。

舉例來說,其中一個細胞可以表現「3 個紅色螢光蛋白 + 5 個藍色螢光蛋白 + 4 個綠色螢光蛋白」,隔壁細胞可能是「1 紅 + 2 藍 + 6 綠」,鄰近細胞間便能呈現不同顏色,讓長期追蹤所有不同細胞成為可能。

將能夠製造紅、藍、綠色螢光蛋白質的基因組,植入斑馬魚的細胞,利用遺傳學技術,讓表皮、肌肉、肝臟等目標組織的每一顆細胞,隨機表現出不同的顏色組合。圖/研之有物(資料來源/陳振輝

將調色盤植入細胞的原理看似簡單,做起來卻要耗費不少功夫,尋找適合的基因轉殖魚需要半年到一年的時間。陳振輝解釋用斑馬魚當實驗材料的優點:它們容易繁殖,生長的週期不用等太久,體積小,容易操作;更重要的是魚體扁平,容易拍攝大面積、高解析度的細胞影像,進行系統性的量化分析。搭配讓每一顆細胞,從誕生到凋逝都無所遁形的全面「監控」影像平台,才有機會觀察到前人視而不見的細胞分裂方式。

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圖片為斑馬魚的仔魚(上圖)和成魚(下圖)的透視圖,仔魚年齡為受精之後第 3~21 天。斑馬魚當實驗材料的優點是:容易繁殖,生長週期不長,體積小,容易操作;更重要的是魚體扁平,容易拍攝大面積、高解析度的細胞影像。圖/研之有物(資料來源/J Clin Invest.

隱藏在「表面之中」的無合成分裂

斑馬魚的皮膚和人類的皮膚基本構造類似。唯一不同是人類的皮膚有角質層覆蓋,斑馬魚皮膚的外層是沒有角質化的活細胞,適合拍照觀察。斑馬魚的另一優點是在顯微鏡下活體觀察時不會傷害到魚體,麻醉後可以直接拍照,再放回水中喚醒;如此才能追蹤同一條魚從出生到長大,身上所有皮膚細胞的動態行為。

研究斑馬魚的學者很多,皮膚發育這回事可謂天天在人們的眼前發生,可是其它人為什麼都視而不見,沒有注意到陳振輝團隊發現的無合成分裂呢?事情其實沒有說起來那麼簡單。

斑馬魚皮膚剖面示意圖,從顯微鏡看到的斑馬魚細胞是最上層的表皮細胞。圖/研之有物(資料來源/陳振輝)

斑馬魚的皮膚分為上中下三層,下層的幹細胞,會分裂產生新的細胞,送到上層成為覆蓋身體最外側的皮膚細胞。其它研究人員如果見到表皮細胞的數目變多,直觀的想法會是下層的幹細胞又送上新的細胞,不會想到是上層既有已分化的細胞可以直接進行分裂。

陳振輝表示,一開始見到表皮細胞的數量增加時,直覺也認為是下層幹細胞產生的新細胞,可是連續追蹤後卻發現不是這麼回事。由於他的技術可以對斑馬魚身上 2,000 到 3,000 顆皮膚細胞進行同時監測,才意外察覺到上層已分化的細胞竟然會不用複製遺傳物質,就直接分裂成兩顆,甚至是四顆細胞!

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陳振輝團隊觀察到斑馬魚表皮上層已分化的細胞可以不用複製遺傳物質,直接分裂成兩顆,甚至是四顆細胞。影/陳振輝

顛覆認知:不用合成 DNA 的細胞分裂

外行人聽起來好像沒什麼,上述發現其實開拓了細胞分裂研究的新領域。精子和卵子這類生殖細胞(germline cell),在複製遺傳物質以後會經過 2 次分裂,形成 4 顆細胞,也就是減數分裂(meiosis)。構成身體的體細胞(somatic cell)則會先複製內部的遺傳物質,再分裂 1 次成兩顆細胞,稱為有絲分裂(mitosis)。

還有較少見的狀況,如 DNA 複製後細胞不分裂,變成多套遺傳物質的 1 顆細胞(endoreplication);或是多個細胞融合在一起,成為 1 顆多核細胞(cell-cell fusion,例如骨骼肌細胞)。

然而不管怎麼分裂,過去研究沒有發現不用複製 DNA 就能分裂的細胞!正常細胞分裂的過程有許多監控機制,如果細胞的遺傳物質沒有完整複製,一般情況細胞應該會啟動相關的監控機制,阻止分裂過程的進行。癌症細胞不受控制的分裂,就是相關機制沒有正常運作。

斑馬魚表皮細胞竟然能在沒有複製遺傳物質的情況下,避免細胞凋亡的命運,持續分裂,是一個很特別的例外。

斑馬魚從仔魚到成魚的發育過程中,表皮細胞可以在沒有複製遺傳物質的情況下持續分裂。圖/研之有物

論文投稿到《自然》期刊後,四位同儕審查者一致給予正面評價,但是顛覆認知的新發現仍受到不少質疑,需要陳振輝團隊進行許多額外的實驗來回答。

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有沒有觀察失誤的可能?

陳振輝團隊同時標記下層、上層的細胞,證實進行分裂的細胞確實位於上層。為了證明遺傳物質沒有複製,他們進一步測量細胞內 DNA 的量,包覆 DNA 的組蛋白(histone)的量,以及施加阻止 DNA 複製的藥劑。

結果顯示分裂後的細胞,遺傳物質的含量確實有等比下降,分裂過程不受阻止 DNA 複製藥劑的影響。顯然細胞沒有合成新的 DNA 就直接分開,陳振輝稱之為「無合成分裂」(asynthetic fission)。

所以,究竟是怎麼分裂的?

顯微鏡下看來似乎沒有一定的章法,有些表皮細胞會分裂 2 次成 4 顆細胞,有些分裂 1 次成 2 顆細胞,還有些不會分裂,維持 1 顆細胞;也發現有少數細胞可以逆轉分裂過程,形成雙核細胞。

陳振輝團隊現有的研究技術,尚無法辨明胞器的分配,以及每一條染色體的分配模式;團隊預計使用單細胞定序(single cell DNA sequencing),在無合成分裂後,分別定序每一顆細胞分配到的染色體組成,以釐清細胞的遺傳物質是否有特定的拆分方式。

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斑馬魚表皮上的無合成分裂(影片箭頭處),還有很多細節尚待研究。陳振輝團隊預計要釐清在無合成分裂之後,細胞的遺傳物質是否有特定的拆分方式。影/陳振輝

一切都是為了節省資源!努力長大的表皮細胞

無合成分裂對斑馬魚有什麼意義呢?斑馬魚由受精卵孵化後,仔魚在前 8 天不用吃東西,成長速度緩慢;第 8 天起開始進食,體型也像吹氣球般迅速膨脹,第 14 天時成長速度達到最快。觀察發現從第 8 天 到 21 天,皮膚細胞會發生無合成分裂,團隊推測此一分裂現象與身體表面積的快速延展息息相關。

斑馬魚的仔魚從受精卵孵化之後的第 8 天到第 21 天,表皮細胞會發生無合成分裂,陳振輝團隊推測此一分裂現象與身體表面積的快速延展息息相關。
圖/研之有物(資料來源/Nature

僅管省略掉複製遺傳物質的階段,細胞進行無合成分裂所花費的時間,卻比一般細胞分裂稍慢,所以其優點並非單純的縮短時間,應該是節省資源。斑馬魚仔魚身體的表面積在特定時間迅速增加,體表需要皮膚細胞的完整覆蓋,團隊發現細胞進行 1 次無合成分裂,表面積能增加 26%,兩次能達到 59%,這些細胞能在斑馬魚體表存活 2 到 3 週的時間。

陳振輝團隊發現,斑馬魚表皮細胞進行 1 次無合成分裂,表面積能增加 26%,兩次則能增加到 59%,這些細胞能在斑馬魚體表存活 2 到 3 週的時間。
圖/研之有物(資料來源/陳振輝)

斑馬魚如何啟動無合成分裂呢?目前仍不太清楚,團隊發現其過程受到表面張力變化的影響。皮膚細胞有感應張力變化的特定離子通道,利用藥物影響這些離子通道的活性,無合成分裂也會受到影響,詳細作用機制仍有待更多的研究。

生活數量的密度也會影響斑馬魚長大

另一項十分有趣的發現是,無合成分裂和仔魚生活的密度有關。斑馬魚從仔魚長到成體,最終的體型都差不多,但是生長過程則有很大的差異,個體成長速度有快有慢。假如將許多仔魚養在一起,處於高密度的生活環境,個別仔魚的生長速度會較慢。

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奇妙的是,一旦換到低密度的環境,仔魚的成長速度會瞬間暴增,體表面積快速增加又要維持皮膚細胞的完整覆蓋,會導致更多的無合成分裂。斑馬魚如何感知、在生理上反應周遭環境鄰居密度的變化,是另一個有趣的研究方向。

斑馬魚若處於高密度的生活環境,仔魚的生長速度會較慢。奇妙的是,一旦換到低密度的環境,仔魚的成長速度會瞬間暴增,體表面積快速增加,導致更多的無合成分裂。圖/研之有物(資料來源/陳振輝)

進行無合成分裂的細胞缺乏完整的遺傳物質,還能算是有生命的活細胞嗎?陳振輝提醒我們,多細胞生物的生理機能由各式各樣的細胞一起維持,某些特化的細胞還沒有細胞核。例如紅血球的成熟會經過脫核的過程,完全沒有細胞核的紅血球有重要的生理功能也可以存活超過 100 天。在斑馬魚體表進行無合成分裂的皮膚細胞,或許也有它們短暫卻不可或缺的使命。

有可能其它生物的細胞也會無合成分裂嗎?

無合成分裂目前只在斑馬魚表皮的發育過程中觀察到,其它細胞、其它生物、其它情境下是否也存在呢?事實上陳振輝自己也很好奇。

以人體來舉例,體表的皮膚,口腔內膜、消化道組織,時時刻刻都需要大量的表皮細胞覆蓋,而且耗損甚鉅,有不斷補充的需求。這些必須持續維持完整覆蓋表面的情境,或許無合成分裂也參與在其中。

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然而,無合成分裂不容易在活體動物直接觀察。例如小鼠的模式,就算能引進三原色調色盤的細胞標誌技術,也不像斑馬魚仔魚那般透明容易拍照。話說回來,知道某個現象有可能發生,就是發現的第一步。假如其它細胞或是生物也存在無合成分裂,在陳振輝團隊邁出第一步以後,未來一定有人能克服相關的技術門檻來進行研究。

發現斑馬魚表皮細胞的無合成分裂,像是開啟一扇新的大門,可以通往過去想像不到的研究方向。會有醫學應用的可能嗎?像癌症是細胞的不正常分裂,任何細胞分裂機制的基礎研究,應該有機會對癌症的治療有所啟發。陳振輝同意這是潛在的研究方向之一,但是他也強調從基礎研究到醫學應用,是很漫長的一段路,科學家能做的就是一步一步踏實前進。

對沒預期的發現保持警覺,在探索過程中充分滿足自己的好奇心,將支持陳振輝持續前進,挑戰下一個研究課題。

對沒預期的發現保持警覺,在探索過程中充分滿足自己的好奇心,將支持陳振輝持續前進,挑戰下一個研究課題。圖/研之有物
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第三種細胞分裂方式「無合成分裂」背後的發現之旅——《科學月刊》
科學月刊_96
・2022/09/03 ・4233字 ・閱讀時間約 8 分鐘

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  • 採訪編輯/張樂妍|本刊編輯

Take Home Message

  • 由於想繪製出再生藍圖的想法,陳振輝踏上以多顏色標誌技術解構再生過程細胞行為的研究旅程。
  • 12 年間他面對各項挑戰,而實驗中一次意外的發現,竟在後來成為突破性的研究,發表在《自然》(Nature)期刊。
  • 陳振輝分享自己一路上所領悟的研究精神,強調科學家不會失敗、有自己的觀點、專心做一件自己覺得好玩的事情,還要勇於妄想。

實驗室的顯微鏡底下,銳利的刀片輕劃過魚尾組織,精確地切除斑馬魚尾鰭固定的面積。但不過一陣子,許多細胞就會開始在傷口邊緣快速移動、增生、修復傷口,數天後完整再生全新的尾鰭組織。

這是斑馬魚(Danio rerio)的再生實驗。為了找出與再生能力調控有關的基因,這隻斑馬魚身上有隨機誘發的突變基因,如果尾鰭的再生出現問題,就可以回頭尋找突變點發生的位置及它所影響的基因。然而,突變發生在相關基因的機率非常低,想找到「再生基因」得全憑運氣。

12 年前,在美國杜克大學(Duke University)生物學家波斯(Ken Poss)實驗室的陳振輝,每一天都重複這項實驗,有時候一天要切上 1000 多條斑馬魚。

蓋房子絕不能缺少藍圖,而細胞再生也是!

因為需要長時間在顯微鏡下觀察再生的過程,陳振輝對於再生從無到有的發生過程感受極深,他覺得「再生」在細胞的層級中,其實和蓋房子很像。

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「你覺得蓋房子最重要的是什麼?」

他認為蓋房子最重要的,是一張詳細的設計藍圖。有了設計藍圖,才可以知道每一層樓需要多少建材,要從何處開始建蓋,水管和電路要如何設計安排;就如同再生過程中,各式各樣不同的細胞,一定也依循著某種既定的藍圖移動、增生,最後建構出型態、功能完整的複雜組織。

如果可以即時、完整記錄所有參與此過程中個別細胞的動態行為,是不是就可以畫出一張最詳細的再生藍圖?某天就可以在人類身上把這個叫做「再生的房子」蓋起來?

陳振輝當時有個簡單的想法:多顏色細胞標誌技術(Brainbow)[註]可以提供很特別的機會,即時解構每一顆細胞在再生過程中扮演的角色,釐清複雜組織如何完整恢復的過程,以及它的調控機制。

只不過要將這個簡單的想法實現並不容易,小小尾鰭的再生其實有上萬個不同種類的細胞 (比如皮膚細胞、骨骼細胞、神經細胞) 參與在其中。面對許多技術層面上的挑戰,一晃眼就是五年。

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  • 註:利用隨機表現三個不同顏色的螢光蛋白(紅、藍、綠),當三種螢光蛋白表現不同的比例,可以產生更多額外的顏色來標誌不同細胞。在理想的實驗條件下,有機會產生上百種不同顏色來標誌有興趣的細胞種類。由於此技術第一次的應用對象是腦神經細胞,因此被命名為 Brainbow(brain + rainbow)。

最適合的模式生物——斑馬魚

「當你在一個研究題目或技術上專注了多年的時間,通常這個過程會反過來改變你這個人和你看問題的觀點。」

在 2016 年,陳振輝結合三種實驗技術——多顏色細胞標誌技術、活體長時間追蹤、大尺度定量分析——首次達到在再生過程中即時、同時追蹤所有皮膚細胞的動態行為,並將此技術另名為「Skinbow」。

以「Skinbow」技術標誌斑馬魚的皮膚表皮細胞,藉由個別的表皮細胞具有不同的顏色,可以長時間追蹤、觀察組織再生的過程。圖/陳振輝提供

這項初步的研究成果帶給陳振輝一些啟發。第一,Brainbow 的應用門檻高,許多細節須注意;第二,要結合上述三種不同的實驗技術,只有斑馬魚這個模式生物最適合;第三,全世界或許只有長時間跟這些技術奮戰的自己最適合這個研究方向。不過在恍然大悟的陳振輝面前,還有許多現實層面的挑戰等待著他。

彩色斑馬魚的實驗若要繼續進行,需要大規模的飼養空間、專屬客製化的影像設備,以及能看到此一研究方向潛力而願意全力支持的學術機構。很幸運地,中央研究院細胞與個體生物學研究所的謝道時前所長提供他最適合的環境。當陳振輝以為所有研究工具都到位的情況下,卻又馬上遇到下一道挑戰。

意外發現第三種細胞分裂方式

在探索表皮幹細胞行為的過程中,陳振輝和博士班研究生陳潔盈意外發現到表皮已分化的上皮細胞竟然會持續分裂,而且這些分裂的細胞不會在過程中複製 DNA。由於目前已知的有絲分裂和減數分裂過程中都包含複製 DNA 的步驟,因此他們觀察到的細胞分裂過程並不屬於任何一種。

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「當下不會去思考這是不是第三種的細胞分裂方式。」陳振輝表示,看見與教科書完全不同的發現,就像是突然看到外星人在地球出現一樣讓人難以置信。要推翻過去多年來學界認定的現象,對科學研究者來說是充滿挑戰的。一方面若是能發現一個全新的生物現象,可以開創新的研究領域,是讓人興奮的一刻;但另一方面也有到頭來一場空的風險。

在四年多的時間裡,研究團隊持續觀察與試驗,發現斑馬魚幼魚在特定的發育階段生長快速,表皮下層的表皮幹細胞以有絲分裂增生,但上層已分化的表皮細胞,不需要 DNA 複製就可以直接分裂產生四個子細胞,是一個有效率延展體表面積的細胞機制。研究團隊將觀察到的現象定義為一種新的細胞分裂方式,終於,他們在 2020 年 12 月將成果投稿到《自然》(Nature)期刊。

但此時,嚴重特殊傳染性肺炎(COVID-19)疫情突然在英國升溫,使得研究團隊時隔兩個月才收到期刊的第一次審稿意見。好不容易收到的回覆,內容卻是四個審稿員多達 60 幾道問題,需要一一詳細解釋。

經過來來回回的審查、修改、補充數據之後,終於在今(2022)年 5 月,第三種細胞分裂方式——無合成分裂(asynthetic fission),正式發表在《自然》期刊中,讓全世界見證這項挑戰學界對基礎生命現象了解的發現。

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科學家就是要不斷挑戰、勇敢前進

如果讀者從一篇新聞去看科學家光鮮亮麗的發表,其實很難看見研究團隊背後付出了多少血汗(有時還會加上淚)。陳振輝的斑馬魚細胞再生研究已經走了 12 年,路途上充滿一次又一次的峰迴路轉。

所以,科學家都是怎麼想「發現的過程」呢?

  • 研究的路上不會失敗

科學研究從來不是一條直線,從「觀察」到「發現」的過程總是曲折、充滿挑戰、沒有捷徑,而且無一例外,但是科學家不會擔心失敗。因為他們相信自己不會失敗——因為科學家不是剛剛克服完前一個挑戰,就是在往下一個挑戰前進的路上

陳振輝表示,科學研究從來都不是一條直線的道路,從觀察到發現的過程有 90% 的時間都在面對挑戰、解決問題。圖/陳振輝提供
  • 要有自己的觀點

克服挑戰的過程要相信自己,但是也不可以盲目地前進,一定要有自己獨特的觀點。大部分領域裡的科學家都專注在觀察細胞的微構造,陳振輝因為一直很想繪製再生藍圖而有了不同的研究方向:在公分等級觀察細胞的集體行為。

「珍奇異獸通常都躲在人煙稀少的地方!」

也因為這個特別的觀點,陳振輝才有機會可以發現無合成分裂的生理意義。

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  • 專心地做一件好玩的事

陳振輝每個禮拜天都在實驗室餵魚,餵魚的時候都會回想到生命中一些特別的時刻,像是第一次拍到 Skinbow 影像的當下。記得當時自己只有一個簡單的想法:「我想讓斑馬魚身上的每一個細胞都變成這樣!」因為科學家都在專心地做一件自己覺得好玩的事情,他們才能一直堅持下去。

「因為發自內心覺得很好玩,所以才會想盡辦法,讓學生、助理、期刊編輯和審稿員都覺得好玩!」

  • 勇敢去妄想

最後、也是最重要的一件事,要知道自己的妄想是什麼。

「妄想」(delusion)和「夢想」(dream)不一樣,它可以支撐我們走過最痛苦、掙扎的時刻。他以各種人物作比喻:「就像《灌籃高手》裡面的赤木,即使再打下去腳會斷掉、再也不能走路,他還是要上場打球,只因他想『稱霸全國』;還有中研院的廖俊智院長,每一次演講都會提到要『阻止全球暖化』的決心;而我自己的妄想,就是繪製『最完整的再生藍圖』。有了妄想,才會不計代價且樂在其中。」

「請問你的妄想是什麼呢?」陳振輝問道。

努力不如預期?換個角度看事情吧!

陳振輝鼓勵所有正在路途上努力的人,不論是實驗結果不如預期、難以解釋,或是論文被拒絕,又或是個人心情低迷、團隊士氣低落時,都可以用 wow 這個字來轉換看事情的角度。

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  • 表皮幹細胞的實驗結果不如預期怎麼辦?
    → Wow!那去看看以分化的表皮細胞在做什麼搞不好更有趣!
  • 看到不符合已知觀念的細胞分裂模式,沒辦法解釋實驗結果!
    → Wow!它們不會複製 DNA!實在太酷了!
  • 實驗室的士氣好低落…… 
    → Wow!難道你會是發現第三種細胞分裂的人嗎?
  • 論文通通被期刊拒絕了……  
    → Wow!《細胞》(Cell)跟《科學》(Science)都不接受,難道是在叫我們去試《自然》(Nature)嗎?

無合成分裂的意外發現,只是研究工作長遠路途的一隅。背後的調控機制尚有待更多的研究,而這種分裂方式是否會發生在皮膚細胞之外的其他細胞、組織,甚至不同的物種上?讓人充滿想像。

顛覆想像的意外發現,除了是再生機制裡一小塊缺失的拼圖,或許也會有機會影響其它領域,像是癌症 (不正常的細胞分裂) 或是傷口癒合 (加速的細胞分裂) 等研究。

抱持樂觀、對意外發現充滿好奇與熱忱的態度,陳振輝將與研究團隊繼續向繪製「全彩再生藍圖」的道路上前進。

2022「中研講堂」宜蘭場

本文感謝陳振輝研究員協助校稿,提供圖片及精彩的演講內容。

  • 〈本文選自《科學月刊》2022 年 9 月號〉
  • 科學月刊/在一個資訊不值錢的時代中,試圖緊握那知識餘溫外,也不忘科學事實和自由價值至上的科普雜誌。

延伸閱讀

  1. Chen, C.H., et al. (2016). Multicolor cell barcoding technology for long-term surveillance of epithelial regeneration in zebrafish. Developmental Cell, 36, 668–680.
  2. Chan, K.Y., et al. (2022). Skin cells undergo asynthetic fission to expand body surfaces in zebrafish. Nature, 605, 119–125.
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