顛覆過去發現！中研院團隊首揭細胞「無合成分裂」登上《Nature》期刊

本文轉載自顯微觀點

乍看以為是寶石結晶的斑馬魚肌纖維、如竹林屏風般的斑馬魚尾鰭，到似貓頭鷹的斑馬魚鏡像圖以及充滿生命力大樹般的斑馬魚神經樹突，每一幅影像都以斑馬魚為題，卻拍出不同的趣味。

本次 Taiwan 顯微攝影競賽八名優選獎中，就有四位得獎者是中研院細胞與個體生物學研究所陳振輝老師的學生。這些拍出技術與美感兼具作品的研究者，分別為 Uday Kumar、Marco De Leon、陳樂融和劉昱秀。

其中， 來自印度的 Uday Kumar 參加第一屆顯微攝影競賽至今，年年獲獎，更榮獲首屆金獎。而他的同儕，來自菲律賓的 Marco De Leon 也因受到他的啟發參賽，於今年獲得優選。

陳振輝老師實驗室主要以斑馬魚為樣本進行再生研究。他的學生們各自探索斑馬魚的不同組織或器官；有人專精於研究心臟、有人專門研究神經，有人則專門研究肌肉纖維。

Uday Kumar 表示，由於每個人研究的方向不同，因此必須從基因工程到成長過程，各自「顧好」自己的斑馬魚。

這些攸關研究進度與實驗設計的斑馬魚，養殖在細生所地下室的魚房。數十個排列整齊畫一的魚缸，裡頭有著各式大小、不同生長階段和品系的斑馬魚。

為了能夠取卵進行基因轉殖，從養殖器皿到時間都必須加以控制。Uday Kumar 表示，除了一般魚缸外，養殖斑馬魚會再裝置一個多孔的產卵盒。晚上將公魚和母魚用隔板隔開，並保持環境黑暗，避免交配產卵。

等到隔天上午將隔板拿掉，讓公魚、母魚相會，並利用光周期誘發產卵、受精後，必須將特製的產卵盒斜置，好讓受精卵下沉到魚缸底部。如此一來，也可避免斑馬魚將受精卵吃掉。

陳振輝老師實驗室專注於「多顏色細胞標誌技術」（Brainbow/Skinbow）。利用基因重組的方式，將紅、藍、綠三種不同色的螢光蛋白在個別細胞裡表現不同數量，依不同比例產生更多顏色來標誌不同細胞。

Uday Kumar 表示，要將目標基因注入細胞內，需要使用顯微注射技術，在立體顯微鏡下將注射管準確地插入受精卵中。

不過這對他來說，顯微注射已經是一件熟練到「像騎腳踏車」般簡單的事，一天注射超過 500 顆受精卵都沒問題。

雖然基因轉殖對這些研究者來說已是熟能生巧的事，但要建立新的基因轉殖魚仍然要花上漫長的時間，通常需要 6 個月到一年，品系才會逐漸穩定。以 Uday Kumar 於 2021 年獲得金獎的作品來說，就是花了兩年才培育出能以正確比例呈現美麗色彩的斑馬魚。

顯微攝影的每一幅作品除了呈現出精彩美麗的影像外，背後更蘊含著每一位研究者精湛的技術以及長久累積的研究心血。

查看原始文章

參考資料

1. 顯微鏡下一抹彩虹，陳振輝，《中央研究院週報》第 1610 期
2. 臺灣斑馬魚中心——中研院分支介紹，黃聲蘋，《中央研究院週報》第 1360 期
3. 心臟、尾鰭與脊椎，那些以斑馬魚進行的「再生」研究
4. 「從動物身上問對問題，就可以找到答案！」陳振輝談斑馬魚的超強再生力

為了理解染色體異常細胞對鑲嵌型胚胎的影響，我們必須要創造出數百個小鼠胚胎，並研究數千個胚胎不同部位的細胞。這麼龐大的工作量需要有一位專職的科學家，也需要資金。

在匯整如何測試這個假設的思緒時，我在絨毛膜採樣檢查後又進行了另一個羊膜穿刺檢查，這個檢查一樣在超音波影像的引導下，將針插入包圍發育胎兒的羊膜囊中，以取得少量的透明羊水樣本來進行分析。保護胎兒的羊水會帶有胎兒細胞，可以用來確認是否具有染色體問題。這次的檢查結果是沒有問題的，我們都鬆了一口氣。不過，得要到我把孩子抱在手上那時，我才能百分之百地放心。

還有其他的好消息是，我有了資源可以進行了解我檢查結果的研究。我在發現懷孕那天所進行的面試，讓我獲得惠康基金會的資深研究補助金。這筆補助金原本打算用在另一個計畫上，不過他們給我足夠的自由度，可以直接挪用其中部分資金來為鑲嵌型胚胎建立模型。

如何製造染色體異常的細胞？

我們有一大堆事情要做。首先，我們得要找到一種可信的方式（最好不只一種）來製造染色體異常的細胞。然後我們還要找到一種方式來標記這些細胞，好讓它們在正常細胞旁發育時，我們可以追蹤到它們。製造異常細胞比我們原先所想得更加困難。海倫測試許多種不同的方法來干擾染色體分離的過程，我們最後用到一種名為逆轉素（reversine）的藥物，這是我們實驗室中另一個研究計畫使用過的藥物。

逆轉素是種小分子抑制劑。我們想要使用逆轉素來抑制染色體分離中的一個關鍵過程。那是一個分子檢查點，在正常情況下會暫停細胞分裂（有絲分裂），直到有正確數目的染色體（帶有 DNA）被拉開，並分離到兩個不同的子細胞間為止。逆轉素會阻斷名為單極紡錘體蛋白激酶（monopolar spindle 1 kinase）的酵素，而這種酵素會在細胞分裂時確保染色體公平分配。

為了確認逆轉素確實會造成染色體異常，我們經由標記隨機選出的三個染色體來分析有用藥及無用藥的胚胎。我們所使用的標記方法名為螢光原位雜合技術（fluorescence in situ hybridization, FISH），這種技術會外加一個探針（短 DNA 序列）及一個螢光標記。當探針在樣本中碰到類似的 DNA 片段時，就會在螢光顯微鏡下發光。經由螢光原位雜合技術的追蹤，確認了海倫使用逆轉素後，確實會增加染色體異常胚胎的數量。

逆轉素的效用是暫時性的，海倫一把藥劑洗掉，檢查點就恢復正常功能。這很重要，因為這表示我們可以將胚胎染色體異常的發生限制在特定的發育期間內。

染色體異常的胚胎能正常發育嗎？

確信可以製造出染色體異常的胚胎後，我們需要確定這些施用過逆轉素的胚胎是否會完全發育。海倫對四細胞胚胎施用逆轉素，並觀察到在發育 4 天後，它們的細胞數量比未施藥的胚胎要來得少。不過雖然細胞數量較少，還是可以形成三組基本的細胞世系。

為了找出施用內逆轉素的胚胎是否可以長成小鼠，我們將這些胚胎植入母體中。這個時間點是在我們創造出體外培養胚胎的技術之前。每 10 個正常胚胎有 7 個會著床，而這個比例在施藥後的胚胎上則降了一半。最重要的是，施用逆轉素的胚胎沒有一個能夠成長為活生生的老鼠。這個實驗顯示，當胚胎中大多數的細胞都出現染色體異常時，它們的發育最終會以失敗收場，即使它們著床了、也發育了一陣子。

製造同時有異常與正常細胞的胚胎

現在我們可以進一步來探討那個重要的問題：若是只有部分胚胎細胞帶有染色體異常，發育又會受到何種程度的影響？為了找出答案，我們必須製造出鑲嵌型胚胎，也就是混合了染色體異常細胞與染色體正常細胞的胚胎。因此我們決定經由製造嵌合體來達到這個目的。

因為我們無法在對同個胚胎施用逆轉素時只讓其中一些細胞出現染色體異常，所以無法經由這個方式製造出鑲嵌型胚胎，因此我們想到了運用嵌合體的作法，將來自不同胚胎的細胞結合建構成嵌合體（鑲嵌型胚胎是由單顆受精卵生長發育而成的）。創造嵌合體而非鑲嵌型胚胎的好處是，我們可以系統性地去研究要具有多少異常細胞才會干擾到發育。很幸運地，這個作法成功了。

海倫在小鼠胚胎從兩細胞階段分裂到四細胞階段時，經由口吸管的方式施用逆轉素，並在八細胞階段將細胞一個個地分開。然後她將來自正常胚胎的四個細胞與來自施藥胚胎的四個細胞結合創造出八細胞嵌合體胚胎。

我們要追蹤細胞的命運就需要標記。我朋友凱特．哈迪安東納基斯（Kat Hadjantonakis）與金妮．帕帕約安努在紐約對小鼠進行基因改良，讓牠們的細胞核具有綠色螢光蛋白，所以我們就採用了具有這種特性的小鼠。我們將這類小鼠胚胎施予逆轉素，施過藥的細胞會與未施過藥的細胞有不同的顏色，這樣我們就可以做出區別。具有綠色螢光蛋白的細胞讓我們可以明確看到新細胞是在何時與何處誕生以及新細胞的後續分裂，還有，若是細胞死亡了，我們也可以看到是在何時與何處死亡的。我們可用此種方式為個別細胞建立「譜系圖」。

染色體異常細胞在胚胎發育過程中會被清除嗎？

我們為這些鑲嵌型胚胎拍攝了影片，以精準追蹤每個細胞的命運。海倫在螢幕上看見，異常細胞數量的下降主要發生在產生新個體組織的那一部分胚胎，也就是上胚層。這些異常細胞會在凋亡的過程中死去，也就是經歷程序性的細胞死亡。在注定成為胚胎本體的那一部分胚胎中，施用過逆轉素的細胞經歷凋亡的頻率是未施藥細胞的兩倍以上。

這個結果表示，在注定成為胎兒的那一部分胚胎中，異常細胞有被清除的傾向。這支持了我的假設，也就是在這一部分的胚胎中，異常細胞競爭不過正常細胞，不過實際運用的機制跟我原來所想的不一樣。

我簡直不敢相信。這是我們真的會研究出重要成果的第一個徵兆，發育中的胚胎不僅可以自我建構，也同樣可以自我修復。幾年前當我懷著賽門那時，絨毛膜採樣檢查所檢測到的染色體異常細胞的後代，有沒有可能在成長為賽門的那部分胚胎中自我毀滅了呢？

——本文摘自《生命之舞》，2023 年 9 月，商周出版，未經同意請勿轉載。

當我第一次驚喜瞥見打破對稱性的可能起源時，我驚訝地發現到這段歷程似乎很早就開始了，而這也為我運用綠色螢光蛋白追蹤細胞分化的研究鋪起了大道。卡羅琳娜與我想要進一步探索這個研究發現，所以我們提出了一個有關其終極源頭的簡單問題：精子進入卵子的位置是否對於胚胎一開始失去對稱性有任何影響？在線蟲與青蛙這類動物的胚胎中確實是這樣，但在哺乳動物（例如小鼠）的胚胎中也一樣嗎？

對稱藝術

當我們將生命的起源以動畫演繹出時，常常看到的影像就是精子設法進入沒有任何特徵的圓形卵子上，並融入其中。若情況是這樣的話，就很難看出精子進入卵子的位置是要如何對未來一切發育有所影響。在這個理想化的卵子上，任一處表面都與其他表面沒有任何差異。不過，當然還是存在有個參考指標，那個等同於「這邊是上面」的指標就是：極體。

極體是從減數分裂的不對稱過程中所產生，細胞「骨架」在這個過程中會聚集以協助細胞進行分裂。這個細胞骨架稱為紡錘體，它會從細胞中心點往細胞邊緣移動，產生出一個大大的卵子與一個小小的極體。我們可以合理認為，紡錘體與染色體的移動可能打破了卵子的對稱性，也造成了擠壓極體的發育。許多人的確注意到極體最終總是會落在受精卵進行分裂的那個平面上。

理查．加德納這位我們之前見過的科學家，發現極體會附著在卵子上，它不只會確立受精卵首次分裂成兩個細胞的那個平面，它還會在幾天後確立出囊胚的對稱軸。這項發現讓我們有所啟發。這真的是因為卵子中的軸向資訊會一直持續到囊胚階段，還是有其他的因素會影響胚胎發育的對稱性？在我們進行科學研究的過程中，我與卡羅琳娜在當下這個時間點想要知道的是，精子進入卵子的位置是否也會影響胚胎發育，並提供第二個定位線索。

卵子上的座標——精子進入的位置會影響胚胎發育嗎？

就像在地表上某個地點跟北極的相對位置，可以定義所謂的經線，我與卡羅琳娜想要知道，精子進入卵子的位置是否也可以提供相對於極體位置的另一位置資訊。若真的是這樣，我們就能更精準確立進行首次分裂的那個平面。這感覺起來很合理，因為極體的形成與精子的進入位置都會重新排列之後會運用在卵子分裂上的細胞骨架。若不是這樣，分裂的那個平面與精子的進入位置之間就只有隨機的關係。

以現代科技來說，我們很容易就可以解決這個問題。我們可以將這個過程拍成影片，來看看從精子進入卵子後到後續細胞進行分裂的幾天之間究竟發生了什麼事。但在我們開始研究的那個年代，不存在這樣的選項。我們無法拍攝小鼠胚胎從受精開始進入發育的影片，要等到幾天後胚胎進入囊胚階段才行。我們只能想辦法去標記精子進入的位置，以便可以追蹤它與受精卵在數小時後首次分裂的那個平面之間的關係。

我一開始想著要用某種自然一點的東西，像是胚胎幹細胞這種非常微小的細胞，在卵子受精後馬上附著在精子進入點上，因為那時還可以看到進入點，但最後我有了更簡單的辦法：我們改用肉眼看不見的微小螢光珠。我們成功了，但我很後悔沒有給這些珠子取個像「微球體」這樣酷炫的科學名稱。當然，同領域人士不認同的不僅僅只是這些珠子要怎麼命名，但「珠子」這個名稱有種簡樸感，所以批評者會用這個名稱來貶低我們的研究，這就是我們得要付出的代價。

一開始很容易就能看到精子是從哪裡進入卵子的。它會留下一個名為受精錐（fertilization cone）的小小凸起。受精錐是由卵子的細胞骨架所建構，並由肌動蛋白的纖維所組成，它大約會凸起半個小時。這時間剛好足夠嵌入一至兩個珠子來標記位置。

我們將這些珠子浸到名為植物血凝素（phytohemagglutinin）的蛋白質混合物中，珠子就會具有黏性。植物血凝素常用於讓細胞聚集在一起。因為人的手不夠穩定，所以卡羅琳娜會以一隻機械手臂來拿取具有黏性的珠子，並將珠子放到卵子的表面上，同時還會以另一隻機械手臂牢牢固定住剛受精的卵子。

雖然珠子很小，直徑只有 0.0001 至 0.0002 公分，但在紫外線的照射下看起來大多了，亮綠色的點讓我們很容易就可以追蹤它的命運。觀察受精卵的發育時，我們發現珠子最終會來到細胞首次分裂所產生的兩個細胞之間的邊緣，或者是非常接近這個地方。

受精卵的分裂平面真的是由精子決定的嗎？

我們一直都在挑戰我們的思考與發現。上述情況有可能是任何落在卵子表面的珠子都會掉進分裂溝（cleavage furrow）中。所以為了確認，我們進行了一項對照實驗，卡羅琳娜將另一顆類似的珠子隨機放在卵子表面的其他地方。令我們欣慰的是，這顆珠子最終沒有掉進細胞分裂時所產生的分裂溝中。對我們而言，這表示精子進入卵子的位置以某種方式「被記住」了，並且成為受精卵偏好進行分裂的地點。換句話說，若我們是對的，受精卵之所以會在這個平面進行分裂，是因為偏好（biased）而非隨機（randomly）。

我們持續獲得了各種新發現。在胚胎從兩個細胞發育成四個細胞的階段中，帶有精子進入標記的那個細胞，會傾向於先進行分裂。這個細胞的命運之所以會改變，是因為精子帶入的物質滋養了它嗎？受精的三天後，精子進入標記會留置在囊胚兩部位之間的邊緣處，一個部位是含有會形成胚胎本體的胚胎部分，另一個則是胚外部分。

這表示了，兩細胞胚胎內的其中一個細胞較容易發育成胚胎，另一個則傾向於變成胚外部分。我們感到震驚。我們觀察影像好幾個小時，甚至好幾天。我一開始根本不敢相信這些發現，所以我請卡羅琳娜一再重複進行實驗，打破早期對稱性的證據怎麼這麼簡單，會不會太簡單了？

可以理解地，對此感到懷疑的人士可能會吹毛求疵地表示，決定分裂平面的不是精子進入點，而是將珠子嵌在進入點的這個動作。為了驗證這個可能性，我們進行了許許多多的對照實驗，我之後會提到。我們已經確認過，將珠子放置在受精錐以外的任何一個地方，都不足以決定分裂的平面。但我們還有諸多其他事項要一而再、再而三的確認，因為我們必須很確定。

——本文摘自《生命之舞》，2023 年 9 月，商周出版，未經同意請勿轉載。