為什麼要研究「醣分子」?
醣分子與生物體內各項生化反應密切相關,但醣分子仍是目前主要生物分子中,對於其結構、機制、合成技術等知之甚少的一塊。中研院原子與分子科學研究所的倪其焜研究員,以化學動力學和量子化學為理論基礎,並利用質譜儀高靈敏的特性,建立另一種醣分子結構鑑定的方式。
醣類,和我們有何關係?
核酸、蛋白質、醣、脂質是生物體內四種最主要的生物分子。脂質結構相對簡單,但是核酸、蛋白質、醣都是巨分子,其結構相當複雜。綜觀過去半世紀以來的科學史,核酸與蛋白質的結構發現與相關技術開發,都成了科學發展中的重大里程碑;唯有「醣類」仍充滿的眾多謎團待解。
醣類由單醣分子組成,每一個單醣分子可由 3 到 7 個碳原子,和特定數目的氫、氧等原子組成。例如:我們耳熟能詳的葡萄糖、果糖、半乳糖,都是由 6 個碳原子所組成的單醣分子,是分子式為 C6H12O6 的同分異構物,亦即擁有相同分子式,但結構式卻不相同。其中葡萄糖和半乳糖的差別,只在連接到 4 號碳原子的 OH 官能基方向不同。
2 個單醣分子可以進行脫水反應後連結成雙醣; 3 到 10 個單醣分子連結成的醣稱為寡醣;更多個單醣分子組成的醣則稱為多醣。我們每日熱量主要來源澱粉、飲食調味用的蔗糖、果糖都是屬於醣類。
不過,醣類並不只是作為熱量的來源而已。
近年來眾多研究發現,醣類參與了多種生化反應、與疾病傳染機制。
例如,牛奶與母乳所含的醣類成分就有些微差距,能對嬰兒腸道內細菌有不同的抑制和促進作用;又例如,禽流感的病毒會與特定的醣分子結合,因此檢測或合成指定的醣分子,就可以發展成快篩鑑定禽流感病毒種類的工具。
醣類結構:排列組合超級多!
雖然與其他生物分子相比,醣類分子的結構看似單純許多。以六碳醣來說,不同單醣分子的差異,只差在連接到不同碳原子的 OH 官能基,有不同的連接角度。但是,這一個小小的差異,卻使得看似相似的醣分子,有著大量的排列組合方式。
以上圖的葡萄糖為例,將葡萄糖溶於水中,會出現「????-葡萄糖」與「????-葡萄糖」兩種首旋異構物(或稱變旋異構物),兩者的差異是:在天然的葡萄糖中,位於 1 號碳原子上的 OH 官能基,大概有 40% 的比例呈現連接角度向下,稱之為 ????-葡萄糖;有 60% 的比例呈現連接角度向上,稱之為 ????-葡萄糖。
而當兩個葡萄糖要結合成雙醣時,兩種首旋異構物的葡萄糖,各自會有四種不同的連接方式,如下圖所示。因此光是由葡萄糖組成的雙醣,就可以有八種不同的同分異構物。兩個葡萄糖些微的不同鍵結方式,有時會有很不同的生化反應。
上圖中,常見的麥芽糖是由兩個 ????-葡萄糖組成,其中一個葡萄糖序號 1 的碳原子,與另一個葡萄糖序號 4 的碳原子相接,在符號上可寫為:????(1→4)。但如果把 ????-葡萄糖改為 ????-葡萄糖,但連接的方式相同時,則會形成人體無法消化的「纖維二糖」,符號上可寫為:????(1→4)。
如果我們再繼續將葡萄醣分子連接下去,4 個葡萄糖分子相連就可以有 928 種組合,5 個葡萄糖分子就會有上萬種的組合。這些不同組合的葡萄糖,有著截然不同的結構,有可能會對應到完全不同的生化反應、或生理機制。
結構,是了解化學反應的第一步。
對於化學家來說,一個分子或物質的功能,取決於它所參與的化學反應。而化學反應是如何發生、為何發生,則取決於分子或物質的結構。因此,確立一個分子或物質的化學結構,是了解化學反應的第一步。
質譜儀:窺見醣的千萬面貌
儘管過去科學界已建立了核磁共振、質譜儀、液相/氣相層析等,多種鑑定複雜分子結構的方式。但對於醣分子來說,由於種類過於多樣、在生物體內的每一種的量都非常少、再加上目前沒有類似核酸或蛋白質的技術,可以將萃取後少量的醣分子複製,造成醣分子的結構鑑定非常困難。因而導致醣分子的研究發展,明顯落後於其他生物分子。目前,學界多利用「質譜儀」來作為分析醣分子結構的工具。
由於質譜儀的偵測能力最為靈敏,僅需要少量的樣本就可以進行實驗,正好適合醣分子多樣卻少量的特徵。
當待測物分子因游離而帶電,例如:被電子轟擊、 雷射游離、附著金屬離子、或附著額外的電子、質子時,會產生帶電分子。質譜儀是藉由量測帶電分子的質量與電荷比例(m/z, 質荷比),來分析待測物分子的質量。
如果供給帶電分子更多的能量,例如:經過碰撞或吸收光,帶電分子會分解產生帶電的碎片。這些不同質量的碎片因為所含原子組成的不同,會有不同的質荷比。由於這些碎片的原子組成,往往和原來分子的結構有關。因此藉由質譜儀量測這些碎片的電荷比例(m/z, 質荷比),及其對應的強度,可以得知分析待測物分子的結構。
我們以一個簡單的蛋白質為例,來理解質譜儀用作定序的原理。假設有某一個已知質量的蛋白質,這個蛋白質是由 4 種不同的質量的胺基酸組成,而 4 種胺基酸排序後,可以有 4! = 24 種排列組合的可能,如下圖所示:
在質譜儀的實驗中,我們可以將蛋白質分子打碎成質量不一致的碎片,並參考這些胺基酸的已知質量,就能進一步估計這些碎片是由哪一些胺基酸鍵結組成;只要碎片的形式夠多,就可以藉此推估該蛋白質內的胺基酸序列,如下圖所示:
像這樣的質譜鑑定技術,被廣泛運用到日常生活。例如食安事件中,為了要確認食品中是否含有某些有害物質,就可以將食物樣本送到質譜儀中,看所檢測出來的質譜是否有對應到資料庫中指定有害物質的質譜。
只是,這種以資料庫質譜比對的方式,對於醣分子的研究仍相當受限。以 4 個葡萄糖分子的組合為例,雖然相連起來會有 928 種 4 醣分子組合,但市面上目前僅能買到 20 餘種人工合成的 4 醣分子產品供質譜儀量測,要合成其他 4 醣分子也是耗時耗力,因此還遠遠無法建立起比對用的醣分子資料庫。
因應無法利用資料庫比對的方式來鑑定待測的醣分子,倪其焜與研究團隊所使用的方式,是以化學動力學和量子化學作為理論基礎,以理論預測醣類分子獲得能量後鍵結斷裂的模式,再與質譜儀實驗結果交互驗證,以此發展出醣分子的質譜儀鑑定技術。
有果必有因,從原理推測結構
以本文前述葡萄糖的兩種首旋異構物為例,如同下圖顯示,這兩種帶金屬鈉離子的首旋異構物在質譜儀中,可以觀察到在質荷比數值 185 處,????-葡萄糖的訊號強度明顯大於 ????-葡萄糖。質荷比 185 的峰值,與帶金屬鈉離子葡萄糖的質荷比 203 的峰值, 剛好相差了一個水分子的分子質量,這代表 ????-葡萄糖比 ????-葡萄糖更容易失去了一個水分子 (H2O) 。
倪其焜團隊從量子化學的理論計算發現:葡萄糖失去了一個水分子的機制,主要是由位置 2 的 OH 官能基裡的氫原子,轉移到位置 1 的 OH 官能基上的氧原子,再經由斷裂位置 1 的 C-O 鍵,脫離一個水分子。
由於 ????-葡萄糖上,位置 1 與位置 2 的 OH 官能基距離,明顯小於 ????-葡萄糖上同樣位置官能基的距離。因此,????-葡萄糖上,位置 2 的 OH 官能基裡的氫原子,要轉移到位置 1 的 OH 官能基上形成水分子 (H2O)的能量障蔽,明顯小於 ????-葡萄糖。
因此,從質譜可以判斷,質荷比 185 峰值較大者,對應的一定是 ????-葡萄糖 ; 質荷比 185 峰值較小者,則是 ????-葡萄糖。
同樣的科學原理,也可以應用到各種雙醣分子 ???? 與 ???? 兩種不同連接角度的糖苷鍵、或醣分子末端的 ???? 與 ???? 不同角度的官能基。透過實驗與理論的交互驗證,就可以在欠缺醣分子資料庫比對、僅擁有極少實驗樣本的情境下,精確地推論與鑑定出醣分子的結構。
醣那麼難研究,何苦選擇它
大家搞不清楚的混沌領域,是科學家開疆闢土的地方!
倪其焜回顧醣質譜的研究歷程,其實也與過去中研院兩任院長的研究有關。如前院長翁啟惠最為知名的研究,就是開發出快速且大量的醣分子合成方式,近年來更將醣分子應用於癌症等治療方式的研發。
但早年研究醣分子時,發現醣分子不僅結構複雜難以分析,相比起蛋白質,醣分子在質譜儀內也難以游離、無法有效鑑定。倪其焜當時發現,主因為當時國際學術界對於醣分子游離的理論與數據解讀有誤,因而與團隊提出了正確且簡單的理論,成功解釋了醣分子的游離機制。
前院長李遠哲,更交付了「提高醣分子游離效率」的任務給倪其焜,由於醣分子的數量稀少且難以人工合成,提高游離效率就意味著:能在有限的醣分子樣本之下,增加實驗的成功率或鑑別度。雖然在後續的研究中,倪其焜研究團隊陸續提出一些改善方式,使游離效率能提高百倍,不過助益仍相當有限。面臨這個挑戰,倪其焜進一步思考,其實人們對於質譜儀內醣分子的鍵結斷裂原理所知甚少,因而發現了這個全新的研究角度。
近年來,科學家大量認知到醣分子的重要性與研究的困難度。倪其焜認為,像醣分子這樣仍屬謎團重重的混沌領域,正是科學家開疆闢土的好地方。中研院在前任院長的支持下,近年建立了跨領域的研究團隊,包含基因體中心、生化所、化學所等,從不同的角度切入,研究醣分子的合成、鑑定,以及醣分子在生化、醫學的功能等。這也是台灣在科學研究上,另一個可以在世界舞台上佔一席之地的契機。
在醣分子研究的歷程上,有可能會遭遇既有理論的瑕疵錯誤,也有可能會欠缺關鍵技術與資源的支持。但若能窮盡物質世界的學理,引進不同研究領域的理論與技術,就有可能在混沌之境,開創出前所未見的研究新視角。
延伸閱讀
- 倪其焜的個人網頁
- Jien-Lian Chen, Hock Seng Nguan, Po-Jen Hsu, Shang-Ting Tsai, Chia Yen Liew, Jer-Lai Kuo, Wei-Ping Hu, and Chi-Kung Ni*. Collision-induced dissociation of sodiated glucose and identification of anomeric configuration. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 15454 (2017)
- Hsu Chen Hsu, Chia Yen Liew, Shih-Pei Huang, Shang-Ting Tsai, Chi-Kung Ni*. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports 8, 5562 (2018)
- Hsu Chen Hsu, Chia Yen Liew, Shih-Pei Huang, Shang-Ting Tsai, Chi-Kung Ni*. Simple Approach for De Novo Structural Identification of Mannose Trisaccharides. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 29, 470 (2018)
本著作由研之有物製作,原文為《醣有千萬面貌,質譜儀來解》以創用CC 姓名標示–非商業性–禁止改作 4.0 國際 授權條款釋出。
本文轉載自中央研究院研之有物,泛科學為宣傳推廣執行單位