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有批蛋白質好便宜的?想說這句話你需要一座「蟲蟲生物工廠」——《科學月刊》

科學月刊_96
・2021/09/15 ・4496字 ・閱讀時間約 9 分鐘

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  • 作者/林家揚|臺大昆蟲學系碩士生。
  • 作者/林鈺淳|臺大昆蟲學系博士生。
  • 作者/吳岳隆|臺大昆蟲學系副教授。
  • 作者/黃榮南|臺大昆蟲學系教授。

Take Home Message

為了大規模生產出我們想要的蛋白質,以製造出疫苗、蛋白質藥物、保養品等產品,目前已有許多方式能進行蛋白質表現。而昆蟲表現系統在細胞培養的成本低,且其蛋白質轉譯後修飾系統和真核生物比較接近,使其具有生產上的優勢,但它還是難以供應大量市場需求。

若能直接把昆蟲當作生產蛋白質的工廠,利用病毒感染蟲體後,再從蟲體的體液中回收蛋白質,便能提高產量、降低生產成本,而這也是所謂「生物工廠」的概念。

嚴寒的冬季往往是許多病毒歡樂肆虐的嘉年華,狡猾的它們趁著天氣寒冷、人們免疫力下降時趁虛而入,並在人體內引起如發燒、咳嗽、流鼻水等症狀。為了避免這樣的情況發生,許多人選擇施打疫苗以抵抗這些病毒,但是我們該如何快速生產這麼多疫苗來供應所有需求? 

傳統疫苗大多由蛋白質組成,而且需求量極高。因此需要一個能夠大規模生產、效率夠高,同時成本較低的蛋白質生產模式,而此生產模式也可以應用在其他和蛋白質相關的產品上,例如蛋白質藥物或保養品等,不過有哪種生產模式能符合這麼多要求呢?

哪些方法能製造出想要的蛋白質?

你第一個想到的也許是基因改造生物(genetically modified organism, GMO,簡稱基改生物),只要靠著修改生物的基因序列,便能替我們生產出需要的蛋白質。雖然這是一種可行的方式,不過以大規模生產的角度來說卻不可行,因為創造基改生物並非一朝一夕就能達成,從完整的生物個體層級來看也是非常困難的事情,更牽涉到生物體內各式各樣的生物系統。

也許我們修改的基因會對生物造成負面影響;又或是修改的基因序列表現量不佳,無法工業化大規模生產,這些潛在因素都可能使得修改基因序列難以成功且無法預測。此外,創造基改生物的成本高昂,以表現特定蛋白質來說,投資基改生物所需的時間和成本並不符合效益。

隨著科技進步,我們目前已經有更多選擇能進行蛋白質表現,包括大腸桿菌表現系統、酵母菌表現系統、昆蟲表現系統、哺乳動物表現系統等(圖一)。由於真核生物(eukaryote)和原核生物(prokaryote)的蛋白質轉譯後修飾(post-translational modification)有所差異,因此大部分會將大腸桿菌和酵母菌的表現系統,應用在原核生物的蛋白質表現;而昆蟲和哺乳動物的表現系統,則應用在真核生物的蛋白質表現。雖然酵母菌是真核生物,但因為其蛋白質轉譯後修飾系統和原核生物比較接近,所以大多還是使用在原核生物的蛋白質表現,那麼我們要如何選擇這幾個表現系統? 

圖一:四種不同的蛋白質表現系統

真核生物和原核生物的蛋白質轉譯後修飾不同,因此大部分會將大腸桿菌和酵母菌的表現系統,應用在原核生物的蛋白質表現;而昆蟲和哺乳動物的表現系統,則應用在真核生物的蛋白質表現。雖然酵母菌是真核生物,但因為其蛋白質轉譯後修飾系統和原核生物比較接近,所以大多還是使用於原核生物的蛋白質表現。圖/Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH, Public Domain, Wikimedia Commons; 123RF; Photo by Andrew Claypool on Unsplash; 123RF)

若是從人類的角度來看,由於人類屬於真核生物,我們該選擇的不是昆蟲表現系統,就是哺乳動物表現系統。而這兩個表現系統又以昆蟲更勝一籌,在大規模生產的考量之下,昆蟲的表現系統在細胞培養的成本遠低於哺乳動物。哺乳動物的細胞培養需要非常多精密又昂貴的儀器和消耗品,例如能控制溫度和二氧化碳濃度的恆溫箱及細胞培養液,使得培養哺乳動物細胞的條件變得非常嚴苛。

由於生產過程的高成本,若想利用哺乳動物的表現系統大量生產蛋白質,便會有一定的困難度,更不用說哺乳動物系統不管是在細胞層級,還是生物個體等,大多都有法規上的問題,這些因素造就昆蟲表現系統在生產上的優勢。

用「病毒」製造出我們要的蛋白質吧!

既然如此,究竟要如何利用昆蟲來大量製造特定的蛋白質呢?答案其實很簡單,就是「病毒」。

病毒在感染寄主細胞後,能夠用寄主細胞內的資源來表現自己的基因,因此只要將病毒基因中的一部分序列,修改成我們想要的目標蛋白質序列,就能藉由病毒製造出特定蛋白質。也因此,「選擇何種病毒」是昆蟲表現系統中的關鍵,這個病毒必須具備能大量表現特定基因的能力,而且其宿主細胞也必須容易培養,這樣才能將產量提升到最高。而在這麼多種的病毒中,能滿足這麼多條件的就只有「桿狀病毒」(baculovirus)了。

目前在昆蟲表現系統上,最被廣泛使用的桿狀病毒是加州苜蓿夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV),屬於桿狀病毒科的一員,是一種雙股 DNA 病毒。核多角體病毒(nucleopolyhedrovirus, NPV)能感染多種鱗翅目(Lepidoptera)幼蟲,例如蝴蝶、飛蛾類幼蟲,而且在病毒感染蟲體後,會產生一種由「多角體蛋白」組成的結構,稱為「包涵體」(inclusion body)。

我們可把包涵體想像為一個用來包裹病毒的堅硬外殼,不只能保護病毒不受到外界傷害,甚至還可以讓病毒在自然環境中存續一年以上。這些能力讓它成為一種具有防治潛力的生物農藥,能以不使用化學農藥的方式控制蟲害。核多角體病毒的感染途徑從鱗翅目幼蟲的口器開始,當幼蟲取食到含有包涵體病毒的葉片後,包涵體就會順著幼蟲的食道進入其體內,到達中腸後,包涵體的多角體蛋白結構會被幼蟲中腸裡的鹼性腸液分解,並釋放出病毒粒子。

由於病毒粒子非常細小,直徑只有 250~300 奈米(nm),寬度也只有 30~60 奈米,可以直接穿過幼蟲中腸的圍食膜(peritrophic membrane)〔註〕;當病毒粒子穿過圍食膜後,會和中腸的上皮細胞接觸並發生膜融合。此時,病毒的蛋白質外殼會在細胞內被分解,而病毒 DNA 則會被送入細胞核中,開始製造出芽型態的病毒(budded virus),這些出芽型態的病毒會在細胞裂解後進入血體腔(hemocoel)內,進一步感染其他組織和細胞,造成二次感染(圖二)。在感染階段的晚期,病毒會大量表現多角體蛋白並組裝成包涵體,在蟲體死亡後釋出到環境中,因此多角體蛋白結構正是昆蟲表現系統中的關鍵。

圖二:核多角體病毒的感染機制

圖/科學月刊提供

該怎麼做出目標蛋白質?

由於多角體蛋白會在病毒感染晚期大量表現,所以只要將多角體蛋白序列換成目標蛋白質序列,就能靠著核多角體病毒大量製造出我們想要的蛋白質。這個概念聽起來非常簡單,不過步驟卻有些複雜。

首先,需要準備一個複製載體(cloning vector)和一個轉移載體(transfer vector),複製載體裡含有我們要插入的蛋白質基因序列,並藉由聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)或是大腸桿菌培養的方式來大量複製;轉移載體則含有多角體蛋白的啟動子(polyhedrin promoter)和一個外來基因的插入位置(multi-cloning site)。之後再利用限制酶(restriction enzyme)和連接酶(ligase),我們便可以將目標基因序列插入轉移載體中,形成重組轉移載體(recombinant transfer vector)。

第二步要準備切除處理過,呈現線狀的桿狀病毒 DNA。由於切除處理過的病毒 DNA 不具活性,因此不會影響接下來轉染(transfection)細胞的步驟;此外,因為它們可能也會被細胞攝入,感染與生成不含有目標序列的野生型病毒,因此先行去除病毒活性對實驗成功率來說相當重要。

最後一個步驟是轉染,將桿狀病毒 DNA 和重組轉移載體一同加進培養好的細胞中。由於重組轉移載體上有桿狀病毒的同源基因(homologous genes),所以當細胞攝入重組轉移載體和桿狀病毒 DNA 後,兩者會發生同源重組(homologous recombination),使得轉移載體上含有目標序列的同源片段,與桿狀病毒 DNA 上同源的位置互換,形成含有目標序列的桿狀病毒,也就是重組桿狀病毒(recombinant baculovirus)。這些重組桿狀病毒便會開始感染細胞,並表現出我們想要的蛋白質(圖三)。

圖三:桿狀病毒表現蛋白質的步驟

圖/科學月刊提供

❶準備複製載體和轉移載體,複製載體裡含有要插入的目標基因序列,再以聚合酶鏈鎖反應或大腸桿菌培養大量複製;轉移載體含有多角體蛋白的啟動子,和外來基因的插入位置。之後利用限制酶和連接酶,將目標基因序列插入轉移載體中,形成重組轉移載體。

❷準備切除處理過線狀的桿狀病毒 DNA。

❸將桿狀病毒 DNA 和重組轉移載體一同加進培養好的細胞中。由於重組轉移載體上有桿狀病毒的同源基因,當細胞攝入重組轉移載體和桿狀病毒 DNA 後,兩者會發生同源重組,使得轉移載體上含有目標序列的同源片段,與桿狀病毒 DNA 上同源的位置互換,形成含有目標序列的桿狀病毒,也就是重組桿狀病毒。這些重組桿狀病毒便會開始感染細胞,並表現出我們想要的蛋白質。

將昆蟲當做「生物工廠」?

以目前桿狀病毒的發展來說,不論生產成本、速度還是生產線建立的難易度,都比哺乳動物的表現系統優勢很多,然而它還是難以供應大量的市場需求。利用昆蟲細胞生產蛋白質依然有一定的成本,若想擴大細胞培養系統也不容易,那如果我們使用整隻昆蟲進行蛋白質生產呢?利用病毒感染蟲體後,再從蟲體的體液中回收這些蛋白質,這樣是否能提高產量、同時降低生產成本呢?

其實這就是所謂「生物工廠」的概念,也就是直接把昆蟲當作我們生產蛋白質的工廠(圖四)。和細胞相比,昆蟲在培養上更加簡單,操作也更為容易,不像細胞需要特別注意有無汙染的情況,也不需要無菌操作台、細胞培養液、恆溫箱,以及提供細胞生長因子的胎牛血清(fetal bovine sera, FBS)等昂貴設備和耗材。以鱗翅目幼蟲的寄主來說,只需要透氣的塑膠容器和人工飼料就可以培養,而這些東西的成本都遠低於細胞所需,加上一隻幼蟲個體所含有的細胞數量也遠超過一個細胞培養皿,使得生物工廠這個概念成為昆蟲表現系統的一個新方向。

以真核生物或是人類需要的蛋白質來說,昆蟲表現系統具有許多哺乳動物的表現系統所沒有的優勢。以桿狀病毒感染昆蟲寄主、從而表現特定蛋白質的方式,不僅成本低、產量高、不受法規上的限制,也更容易設計出產業上的供應鏈,若是有真核生物蛋白質的需求,不妨考慮看看昆蟲表現系統吧!

圖四:利用蟲體作為生物工廠

圖/科學月刊提供

註解

  • 〔註1〕圍食膜是一種在昆蟲中腸裡,用來保護腸壁細胞的膜狀結構,有如人類腸胃中的黏膜。
  • 科學月刊/在一個資訊不值錢的時代中,試圖緊握那知識餘溫外,也不忘科學事實和自由價值至上的科普雜誌。
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科學月刊_96
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非營利性質的《科學月刊》創刊於1970年,自創刊以來始終致力於科學普及工作;我們相信,提供一份正確而完整的科學知識,就是回饋給讀者最好的品質保證。

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被 Covid-19 感染後,病毒進入人體後去了哪裡?嗜好你哪一個細胞?——《從一個沒有名字的病開始》
商周出版_96
・2022/11/14 ・3757字 ・閱讀時間約 7 分鐘

我們的生命被機緣所定義,即使是那些我們錯過的。
——《班傑明的奇幻旅程》

「有症狀的人,請戴口罩。」

這是長久以來,預防呼吸道感染的策略。我們一貫以呼吸道症狀,來辨識誰是那個可能散播病毒的「行動病毒複製機」。但隨著新冠病毒的出現,呼吸道症狀不再適用於辨識感染性與否;於是在疫情蔓延期間,防疫策略是無論有沒有症狀都得戴上口罩,甚至激進一點的作法,直接規定大眾關在家中、減少移動。

疫情蔓延期間,無論是否有症狀都得戴上口罩。圖/Pixabay

但是病毒真的這麼安分,就只待在呼吸道嗎?透過不同研究,我們可以一窺在 Omicron 出現前,新冠病毒在人體內到底「去了哪裡」。

最受新冠病毒青睞的人體細胞

新冠病毒透過棘蛋白與人類細胞表面的 ACE2 蛋白質受體結合。與特定細胞受體結合,是病毒「可能」入侵人體的第一個步驟。

那麼人體中哪些地方有最多 ACE2 呢?不管是口腔或鼻腔黏膜的上皮細胞,都有非常高量的 ACE2。

值得注意的是,與 SARS 病毒相比,新冠病毒棘蛋白與人體 ACE2 分子的親和力,增加了 10~20 倍[1]

也就是說,當你吸入含有病毒的空氣(機率較低),這些新冠病毒在路過上呼吸道之際,附著在上皮細胞的機率可能是 SARS 病毒的 10~20 倍,或者更有可能是透過你沾染病毒的手,觸摸鼻腔、口腔、眼睛的黏膜表皮(機率較高),而給了病毒機會感染上皮細胞。這足以解釋,為何新冠病毒最初感染階段,都是先在上呼吸道複製,且被感染的人甚至在沒有症狀的情況下,就具有傳播病毒的能力。這一點與 SARS 病毒非常不一樣,SARS 主要感染下呼吸道,且病人要在肺炎重症發病後 3~4 天才具有效感染性。

2020 年新冠疫情剛爆發時,穿梭在東亞各國的鑽石公主號遊輪[2],因為一位被感染的乘客在香港上了船,造成全遊輪被隔離在日本橫濱港。最終咽喉試子呈 PCR 陽性的有 712 人(占 19.2%),其中超過 50% 的人自始至終都沒有覺察到病毒的存在,這就是無症狀感染的比例。另外,約有 20% 的感染者出現下呼吸道肺炎症狀,以及 30% 屬於輕症的上呼吸道感染。整體來看,最大宗的感染者(80%)呈現輕微或無症狀。

而根據研究,24% 的確診者,眼睛結膜試子也會呈 PCR 陽性,陽性率約可維持五天左右。

現在就很清楚,為什麼防疫宣導一直告訴大家不要用手摸眼睛、嘴巴、鼻子,這是絕對有科學根據的。這些黏膜表皮,就是病毒入侵人體的要害,同時是人體系統受到影響的元凶,值得持續探討。

免疫機制控制病毒不亂竄

病毒在口腔或鼻腔黏膜上皮細胞的複製過程中,我們的身體也不是閒著沒事等病毒大軍進攻。當病毒嘗試與 ACE2 結合時,人體有足夠的時間,透過自身的先天性免疫反應對付病毒。

當免疫系統開始作用,我們可能會出現發燒、流鼻水、咳嗽等症狀。因為鼻腔與口腔是貫通的,病毒可以緩慢移到口咽、鼻咽、喉咽和整個上呼吸道,附著在黏膜上與 ACE2 結合進行複製。所以當我們使用快篩劑,無論是鼻咽或是唾液快篩,很容易從這些部位檢測到病毒。

鼻咽或是唾液快篩容易檢測到病毒。圖/Envato Elements

如果身體的先天免疫機制和肺部防禦能力夠強,透過上呼吸道局部的免疫反應,將病毒圍堵並控制,就可以預防病毒侵入下呼吸道和其他器官。病毒感染上呼吸道的表皮,並沒有影響到關鍵的人體功能(嬰幼兒除外,因為他們的呼吸通道較窄小,若有任何發炎腫脹,就可能造成呼吸困難的緊急狀況),因此新冠感染者多數呈現無症狀,或者可能只有輕微的上呼吸道症狀。最終新冠患者在完全無症狀或症狀輕微的情況下,有效地抵抗了病毒的入侵;大多數健康的年輕感染者都是這樣的情況。

但若是入侵的病毒量過高,或個人先天性的免疫力不足,病毒會在體內持續擴散。嚴重呼吸道感染症狀,甚至呼吸衰竭,可能發生在 1~3% 的人身上,而且經由解剖的結果已證實呼吸衰竭是最主要的死因。

德國解剖註冊中心在 2021 年10 月之前就已收集 1,129 名新冠疫歿者的解剖資料[3],認定 86% 的死因為新冠病毒感染,14% 為其他共病。研究發現,肺部的病變,以及病毒侵襲肺細胞,以至於大量發炎細胞浸潤,從而得出「嚴重發炎反應造成肺功能衰竭」是最主要的死因這個結論。

新冠病毒讓我們再度正視,肺臟這個重要器官,因其功能所需而座落在如此易受傷害的人體部位。台灣每年的十大死因,肺炎都有上榜,可見不論健康與否,一不小心,肺炎都可能成為終結生命的最後一根稻草。

病毒與你的「表面關係」可以很長久

我們已經知道新冠病毒嗜好人體的呼吸道,除此之外,它還有其他落腳處嗎?

回答這個問題之前,得先釐清一個重點:不同變異株喜歡去的人體部位不一樣。Delta 嗜好感染肺部,Omicron 的感染位置大多止於上呼吸道的咽喉部位。(參見第三章)

為什麼要知道病毒在我們體內去了哪裡?根據觀察,新冠確診者癒後可能出現各式與呼吸道功能無明顯關係的症狀,也就是現在俗稱的「長新冠」(Long Covid)。病毒學家因此懷疑,病毒是否透過不同機制持續存活在人體內,造成更深層的器官感染,才會導致多元症狀的長新冠出現。這是非常值得探討的問題。

事實證明,的確如此。

病毒透過不同機制持續存活在人體內。圖/Envato Elements

除了呼吸道的分泌物及口水(咽喉感染相關)等新冠診斷的主要檢體外,糞便也經常被檢測到病毒存在的跡象,頻繁到可以用下水道的病毒監測系統瞭解疫情的起伏,甚至可以監測變異株的多寡[4]

腸胃道:病毒長存的溫床

病毒不只頻繁出現在糞便中,還會長期存在某些人的腸胃道內。史丹佛大學團隊進行的長期研究[5],針對 113 名新冠輕症與中症的病人(重症已被排除),追蹤研究十個月,收集並分析他們糞便中是否仍有病毒 RNA。

結果發現,在確診後的第一週內,49.2% 的患者糞便中可檢測到新冠病毒 RNA; 四個月後仍有 12.7% 的人糞便中檢測得到病毒 RNA,但此時這些人的口咽試子的病毒 RNA 都已呈陰性,而在七個月後, 還有 3.8% 的人糞便中仍能檢測到病毒 RNA。仔細分析後,發現胃腸道症狀(腹痛、噁心、嘔吐)與病毒 RNA 是否持續存在於糞便中具有關聯性。

作者同時提醒,以上研究是在變異株 Omicron、Delta 出現之前進行的。不同變異株可能對呼吸道與胃腸道有不同嗜好或親和力,可能也會表現出清除率(每單位時間去除某種物質)的差異,這是病毒變異株固有的生物學特點,可能影響潛在疾病的特性。同時病毒如何存在於體內,也會受到自然感染生成的免疫反應,或疫苗接種引起的宿主免疫狀態的影響而有所差異。

病毒如何存在於體內會受疫苗接種引起的宿主免疫狀態而有所差異。圖/Envato Elements

另一項多中心的合作研究[6],長期追蹤 87 位新冠確診患者六個月,發現他們的 RBD 特異性記憶型 B 細胞數量維持不變(沒有減少),還出現單株抗體細胞有更新的現象,表達的抗體具有更多抗原差異,但病人血清對原始病毒株的中和抗體效價則持續下降。這表示六個月後,這些確診病人體內的 B 細胞仍持續對新冠病毒製造的分子作出反應,而這些病毒分子的來源就是腸胃道。研究指出,14 位確診者當中有一半可以在他們的小腸中檢測到新冠病毒 RNA,同時呈現陽性免疫反應。

病毒不只長存於腸胃,而且還是活跳跳的病毒。另一項研究[7]提供了充分證據。該研究追蹤免疫功能下降的病患,在確診一年之後,還可以從他們的盲腸組織細胞及乳房細胞直接培養出活病毒。研究者的結論是,免疫功能低下的患者,同時經歷了長新冠症狀和持續的病毒複製。整體而言,這些研究結果以及新興的長新冠研究,提高了胃腸道做為病毒長期藏匿之處,且可以長期影響症狀的可能性。

最後我們要問,除了上述提及的部位,還有其他人類的分泌物可以檢測到病毒嗎?我們必須釐清病毒會在哪些分泌物出現,以便在執行防疫措施時,可依重點需求區分輕重緩急的必備資訊,否則防疫很容易落入草木皆兵,造成不必要的恐慌與浪費資源。

* 本文內容所引用的文獻均發表在 Omicron 出現之前。基於 Omicron 與其他變異株在細胞嗜性的差異,本文部分內容不適用於 Omicron 感染。

——本文摘自《從一個沒有名字的病開始》,2022 年 11 月,商周出版,未經同意請勿轉載。

參考資料

  1. Wrapp et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 2020 Mar 13;367(6483):-1263.
  2. Sakurai et al. Natural History of Asymptomatic SARS-CoV-2 Infection. N Engl J Med. 2020 Aug 27;383(9):885-886.
  3. von Stillfried et al., First report from the German COVID-19 autopsy registry. Lancet Reg Health Eur. 2022 Feb 18;15:100330.
  4. Amman, et al. Viral variant-resolved wastewater surveillance of SARS-CoV-2 at national scale. Nat Biotechnol (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01387-y
  5. Natarajan, et al. Gastrointestinal symptoms and fecal shedding of SARS-CoV-2 RNA suggest prolonged gastrointestinal infection. Med (N Y). 2022 Jun 10;3(6):371-387.e9.
  6. Gaebler, et al. Evolution of antibody immunity to SARS-CoV-2. Nature. 2021 Mar;591(7851):639-644.
  7. RNAhttps://www.researchsquare.com/article/rs-1379777/v2
商周出版_96
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閱讀商周,一手掌握趨勢,感受愜意生活!商業出版為專業的商業書籍出版公司,期望為社會推動基礎商業知識和教育。

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從昆蟲的習性可以預測天氣?敢有影(kám ū-iánn)?——《取得身邊的天氣密碼》
晨星出版
・2022/11/13 ・1501字 ・閱讀時間約 3 分鐘

溫度對昆蟲至關重要,因此昆蟲會對溫度產生反應。

有一個普遍的通則:炎炎夏日中,你會先看到大昆蟲,接著見到小昆蟲,最後又再一次碰到大昆蟲。昆蟲愈大,愈能忍受低溫、對高溫愈難耐;因此大昆蟲喜歡在一天的清晨或傍晚的涼爽期間出現,中午的活動力較低;小昆蟲較不耐低溫,會在環境變暖時才現蹤。

夏日裡能常看到昆蟲。圖/Pexels

昆蟲與氣溫密不可分

蘇格蘭高地的糠蚊(Ceratopogonidae)總是令人難受,但可以利用牠們對溫度的敏感度對付牠們。糠蚊蓬勃生長的溫度帶相當狹窄,介於不冷也不熱的溫度之間,因此只要你往上爬/向下走,溫度會上升/下降至牠們的舒適圈之外,就能擺脫牠們。

蟋蟀代表了溫暖的氣溫是眾所皆知的事,此外,蟋蟀的聲音頻率與溫度有直接關係。雖然因不同物種而異,但蟋蟀溫度計主要的規則是,在攝氏十三度的環境裡,蟋蟀每秒鐘叫一聲,且此頻率會隨著溫度上升而增加。

在夏天,天氣溫煦、潮溼且微風徐徐,飛蟻會成群結隊地移動。牠們結伴飛過天空,數量多到人們相信「飛蟻日」的存在,飛蟻日說的正是飛蟻同時在全國各地現蹤的日子。不過,正如我們所知,陸地上的微氣候變化甚大,因此知道飛蟻日是個迷思也不該為之震驚,只是某幾個區域的條件正巧在那幾日適合飛蟻出巡。倘若你遇見一大群飛蟻,牠們捎來的訊息是,現在的氣溫大約攝氏十三度,風速低於每秒六公尺。

螞蟻藏著天氣機密?

據某些傳說所言,螞蟻直線移動代表壞天氣即將到來,但我未觀察過也沒有科學理論能佐證這點。

更有趣的是,澳洲原住民有一個習俗,說螞蟻在蟻窩周遭蓋高牆表示大雨將至,西方也有相同的俗諺。之前的章節提過太平洋諸島的居民發現小火蟻(red ant)會在風雨來襲前堵住巢穴,天氣晴朗時則大敞家門,這在西方諺語裡也提過。我還沒觀察到這個現象,但出現在廣泛的文化圈,甚至是兩個信仰社會尚未接觸的時間點就已發展出這種說法,說它沒有參考價值還真不為人所信。

許多科學研究能支持螞蟻對溼度敏銳的觀點:研究人員曾觀察到編織蟻(weaver ant)在熱帶風暴來臨前織網。

編織蟻(Oecophylla),英文稱之為Weaver Ant和Green Ant。圖/維基百科

其他物種裡,螞蟻、白蟻丘的排列和太陽脫不了關係。澳洲北部,羅盤白蟻(Amitermesmeridionalis)建造了指向北邊的蟻丘而為人所知;蟻丘細細的部分指著中午的日頭,寬闊的部分則指向清晨與向晚的太陽,這有助於調整蟻窩的溫度。

世界上有超過一萬三千種獲得命名的螞蟻物種,牠們都擁有各自的習性,我們要多關注近身物種的行為。

我時常運用一些螞蟻的方式,它們比起天氣更接近自然導航,不過兩者間有許多重疊的部分。在英國,排水性佳的草地經常可見黃土蟻(Yellow meadow ant)的身影,我家附近的白堊山丘就有很多。黃土蟻呈暗黃色,牠們的蟻窩比螞蟻本身有用多了;黃土蟻會將蟻窩向上堆到 0.5 公尺高,較為平坦的那一面通常面向東南邊,可以充當太陽能板,在涼爽的早晨收集太陽的熱量。

——本文摘自《解讀身邊的天氣密碼》,2022 年 10 月,晨星出版,未經同意請勿轉載。

晨星出版
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【2004諾貝爾化學獎】蛋白質的分解機器
諾貝爾化學獎譯文_96
・2022/09/12 ・6710字 ・閱讀時間約 13 分鐘

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本文轉載自諾貝爾化學獎專題系列,原文為《【2004諾貝爾化學獎】蛋白質的分解機器

  • 譯者/蔡蘊明|台大化學系名譽教授

譯者前言:今年的諾貝爾化學獎又落入了生化學家的口袋,連續兩年頒給生化學者並不常見,我想這應該是反映了現在化學研究的熱門趨勢。今年的諾貝爾化學獎讓我們注意到細胞是如何精妙的去控制它的蛋白質系統,昨日(十月六日)我在中研院生醫所聽了一場 2002 年諾貝爾生理及藥學獎的得主 H. Robert Horvitz 的演講,那是另一個熱門的題目:細胞凋亡,真是一場精采的演講,同樣的我們看到這些蛋白質的另一種運作。前幾日與一位生技系的學生聊到他未來想走的方向,言談之間他似乎認為蛋白質的化學已經熱門了好一陣子了,恐怕熱潮已過。不過從現實來看,在諾大的生命體系中,我們對它的瞭解實在是太少了,由這些蛋白質的研究看來,我覺得蛋白質的化學仍應是方興未艾吧!

後記:  詹健偉是我在 2003 年教過的學生,他原在植微系,後來轉入了生化科技系,從起初對生物系統的興趣加上對化學的熱愛導致他轉入生化科技的領域,然而這些年他逐漸的體認:「只有化學才能完美的解釋生物體系」,現在他已經決定投入“化學生物學”的領域。健偉是個認真的學生,他讀我的翻譯文章極為仔細,更進一步的從一個學生化的背景看出我許多翻譯的謬誤以及不通順之處。約莫半年前碰到他,他主動的提及願意幫我修改,一直到最近才讓我如願。有學生如此,是我的福分,感謝健偉也祝福他!

— 蔡蘊明 謹誌於 2006 年 10 月 9 日

一個人的細胞中含有上百萬種的不同蛋白質,它們具有無數的重要功能:例如以酵素(或稱為酶)的型式存在的化學反應加速者,以荷爾蒙的型式存在的訊息傳導物質,在免疫的防禦上扮演要角以及負責細胞的型態和結構。今年的諾貝爾化學獎得主:席嘉諾佛(Aaron Ciechanover)、赫西柯(Avram Hershko)以及羅斯(Irwin Rose)研究在細胞中如何對一些不需要的蛋白質加上一種稱為泛素(ubiquitin)的多胜肽標籤,藉以調節某些蛋白質的存在,他們的研究在化學知識上有重要的突破。這些被加上標籤的蛋白質,接著會在一個稱為蛋白解體(proteasome)的細胞"垃圾處理機"中迅速的降解。

透過他們發現的這個蛋白質調節系統,這三位學者使得我們能在分子的層次瞭解細胞如何的控制許多重要的生化程序,例如細胞週期、DNA 的修補、基因的轉錄以及新合成之蛋白質的品質管制。有關這種形式之蛋白質凋亡控制的新知識也使得我們能解釋免疫防禦系統如何的運作,這個系統的缺陷可造成包括癌症在內的不同疾病。

被貼上毀滅標籤的蛋白質

分解是否需要能量?

當大部分的注意力和研究都集中在企圖瞭解細胞如何的控制某些蛋白質的合成時(這方面的研究產生了五個諾貝爾獎),與其相反的蛋白質降解則一直被視為是較不重要的。其實有一些簡單的蛋白質降解酶是早就知道的,一個例子就是胰蛋白酶(trypsin),這是一個存在於小腸中,將食物中的蛋白質分解為胺基酸的一種酵素。類似的,有一種稱為溶體(lysosome)的細胞胞器也早就被研究過,它的功能是把由細胞外吸入的蛋白質降解。這些降解程序的共通性在於這些功能不需要能量。

不過早在 1950 年代的實驗就顯示要分解細胞本身所具有的蛋白質是需要能量的,這個現象一直困擾著研究者,這個矛盾也就是今年的諾貝爾化學獎的背景:亦即細胞內蛋白質的分解需要能量,但是其它蛋白質的分解卻不需要額外的能量。解釋這個需要能量的蛋白質分解過程是由 Goldberg 與其研究夥伴在 1977 年踏出了第一步,他們從一種稱為網狀紅血球(reticulocyte)之未成熟的紅血球,製造出一個不含細胞的萃取物,倚賴ATP(ATP = adenosine triphosphate;是一種細胞的能量貨幣)的能量,這種物質可以催化不正常蛋白質的分解。

運用這個萃取物,今年的三位諾貝爾化學獎得主在 1970 年代後期及 1980 年代初,透過一系列劃時代的生化研究,成功的顯示在細胞中的蛋白質分解,是透過一系列一步步的反應,導致要被摧毀的蛋白質被掛上一個稱為泛素(ubiquitin)的多胜肽標籤。這個過程使得細胞可以非常高的專一性分解不需要的蛋白質,而且就是這一個調控的過程需要能量。與可逆的蛋白質修飾例如磷酸化(1992 年的諾貝爾生理醫學獎)不同之處是:被聚泛素化(polyubiquitination)調控的反應,常是不可逆的,因為被掛上標籤的蛋白質最後被摧毀了。大部分的這些工作是在以色列 Haifa 大學的赫西柯以及席嘉諾佛在休假年,於美國費城的 Fox Chase 癌症中心的羅斯博士的實驗室所完成的。

泛素的標籤

這個後來被發現用在需要分解掉的蛋白質上所貼的標籤,早在 1975 年就從小牛胸腺中被分離出來,它是一個由 76 個胺基酸所組成的多肽,該分子被認為參與在白血球的成熟過程中,其後由於這個化學分子在各種不同的組織和生物體中(細菌除外)亦被發現,因此被賦予了泛素(ubiquitin)的名稱(ubique在希臘文中有到處或廣泛的意思)(圖一)。

(圖一)泛素:一個共通的多胜肽代表"死亡之吻"

發現由泛素所媒介的蛋白質分解

在赫西柯取得博士學位之後,研究了一陣子肝細胞中倚賴能量的蛋白質分解,不過在 1977 年決定改為研究上述的網狀紅血球萃取物,這個萃取物含有大量的血紅素,嚴重的影響實驗,在企圖利用層析法來去除血紅素時,席嘉諾佛以及赫西柯發現這個萃取物可被分成兩個部分,二者個別都沒有生化活性,但是他們發現一旦二者混合在一起,那個倚賴 ATP 的蛋白質分解活性就恢復了。在 1978 年他們發表了其中一個部分中的具活性物質,是一個對熱穩定的多肽,分子量只有 9000,他們稱之為 APF-1,這個物質後來證實為泛素。

席嘉諾佛,赫西柯,與羅斯在 1980 年發表了兩份決定性的突破工作,在這之前 APF-1 的功能是完全不清楚的。這頭一份報告顯示 APF-1 是以共價鍵(就是一種很穩定的化學鍵結)與萃取物中的各種不同蛋白質結合。在第二部份的報告更進一步的顯示有許多個 APF-1 鍵結在同一個目標蛋白上,此一現象被稱為聚泛素化(polyubiquitination)。我們現在知道這個將目標蛋白質多次泛素化的步驟,是一個導致蛋白質在蛋白解體(proteasome)中降解的啟動信號;也就是這個聚泛素化反應,在蛋白質貼上降解的標籤,或可稱其為"死亡之吻"。

就這麼一擊,這些完全未預期的發現,改變了其後的研究方向:現在就可以集中力量開始鑑定那些將泛素接上蛋白質標靶的酵素系統。由於泛素普遍的存在於各種不同的組織和生物體中,大家很快的體認到,由泛素所媒介的蛋白質分解對細胞一定是很普遍而重要的。研究者更進一步的推測,那個倚賴 ATP 的能量需求,可能是為了讓細胞控制這個程序的專一性。

這個研究領域就此大開,而在 1981 到 1983 年間,席嘉諾佛,赫西柯,羅斯與他們的博士後研究員及研究生發展了一套“多重步驟泛素標籤化假說”,這個假說是基於三個新發現之酵素的活性,他們稱這三個酵素為 E1、E2與E3(圖二)。我們現在知道一個尋常的哺乳類細胞含有一個或數個不同的 E1 酵素,大約幾十個 E2 酵素,以及幾百個不同的 E3 酵素,就是這個 E3 酵素的專一性,決定了在細胞中要為哪些蛋白質貼上標籤,然後在垃圾處理機中摧毀。

到這個節骨眼為止,所有的研究都是在沒有細胞的系統中進行的,為了也能夠研究泛素所媒介的蛋白質降解之生理功能,赫西柯與其協同工作人員發展了一種免疫化學方法:用數種放射性胺基酸,以瞬間脈衝的方式來培養細胞,可標定細胞內某一個瞬間所合成的蛋白質。但是泛素中剛好沒有這幾種胺基酸,所以在這瞬間合成的泛素並未被放射性標記。利用泛素的抗體,可以將 "泛素-蛋白質"複合體自該細胞中分離出來,而其中的蛋白質的確具有放射性標記。實驗結果顯示,細胞中也確實以泛素系統來分解有缺陷的蛋白。我們現在知道細胞中大約 30% 的新合成蛋白質都會被垃圾處理機分解,因為它們沒有通過細胞的嚴格品質管制。

(圖二)泛素所媒介的蛋白質降解
  1. E1 酵素活化泛素分子,這個步驟需要 ATP 形式的能量。
  2. 泛素分子被轉移到另一個不同的酵素 E2。
  3. E3 酵素可辨認需要摧毀的目標蛋白質,"E2-泛素"複合物和"E3酵素"結合的位置,非常接近目標蛋白質。這個非常接近的距離,使得泛素標籤足以被轉移到目標蛋白上。
  4. E3 酵素釋放出具有泛素標記的蛋白質。
  5. 最後一步重複數次直到一個由泛素分子構成的的短鏈接在目標蛋白質上。
  6. 這個泛素的短鏈在垃圾處理機的開口處被辨識後,泛素標籤脫落而蛋白質被允許進入並被切成碎片。

蛋白解體-細胞的垃圾處理機

什麼是蛋白解體?一個人類細胞含有約 30,000 個蛋白解體,這個桶狀的結構體可以基本上將所有的蛋白質分解為七到九個胺基酸長短的胜肽,蛋白解體的活性表面是位於桶的內璧,也就是與細胞的其它部份是分隔開來的,唯一能進入蛋白解體的桶中活性表面的方式是必須透過"鎖",鎖能夠辨認接有多個泛素構成的短鏈之蛋白質,藉由 ATP 的能量將蛋白質變性(denature),並在泛素構成的短鏈移除後允許蛋白質進入,並將之降解,降解出來的胜肽由蛋白解體的另外一端釋放出來。因此蛋白解體本身並不能挑選蛋白質,決定哪一些蛋白質需要貼上銷毀的標籤,是 E3 酵素的工作。(圖三)

(圖三)細胞的垃圾處理機。黑點代表具有蛋白質分解活性的表面。

最近的研究

當貼上泛素標籤的蛋白質分解過程背後的生化機制在 1983 年被暴露後,它在生理學上的重要性尚未能完全掌握,雖然知道它在銷毀細胞內具有缺陷的蛋白質上是非常重要的,但是再進一步的,就需要一個突變的細胞來研究泛素的系統,藉著仔細的研究一個突變的細胞與正常的細胞在不同的生長條件下有何不同,希望知道細胞中有哪些反應是與泛素的系統有關,這才能得到更清晰的概念。

一個突變的老鼠細胞在 1980 年由一個東京的研究小組分離出來,他們的突變老鼠細胞含有一個因為突變之故而對溫度非常敏感的蛋白質。在較低溫度時它能發揮應有的功能,但是在高溫時則否,因此在高溫時培養的細胞會停止生長。此外,在高溫時它們顯示其 DNA 的合成會有缺陷以及一些其它的錯誤功能。一群在波士頓的研究人員很快的發現這個突變鼠細胞中對熱敏感的蛋白質是泛素活化酵素 E1,顯然泛素的活化對細胞的運作及複製是不可或缺的,正常蛋白質分解控管不僅對細胞中不正確蛋白質的銷毀很重要,也可能參與了細胞週期、DNA 的複製以及染色體結構的控管。

從 1980 年代末期開始,研究者鑑定出許多生理上很重要的基質是泛素所媒介的蛋白質分解機制中的標靶,在此我們僅提幾個最重要的為例子。

避免植物的自我授粉

大部份的植物是兩性或雌雄同株的,自我授粉將會導致基因多樣性的逐漸喪失,長期而言將造成該物種的完全絕滅,因此為了避免這個情形,植物利用泛素所媒介的蛋白質分解機制來排除"自身"的花粉,雖然完整的機制尚未明朗,但是已知 E3 酵素參與了運作,而且當加入蛋白解體的抑制劑時,排除自身花粉的能力就被削弱。

(圖四)細胞週期中控制染色體分離的機制:剪刀代表分解蛋白質的酵素而綁住剪刀的繩子代表它的抑制劑,APC 將這條繩子貼上標籤造成繩子的分解,剪刀就會釋放出來,接著將那條綁在染色體周圍的繩子切斷,最後造成染色體分離。

細胞週期的控制

當一個細胞要複製自己的時候會有許多的化學反應參與其中,在人體中的 DNA 有六十億個鹼基對必須複製,它們聚集成必須拷貝的 23 對染色體。普通的細胞分裂(也就是有絲分裂),形成生殖細胞(減數分裂),都與今年的諾貝爾化學獎的研究領域有許多交集。在此運作的 E3 酵素稱為"有絲分裂後期促進複合體"(anaphase-promoting complex簡稱 APC),其功能在檢查細胞是否離開了有絲分裂期,這個酵素複合體也被發現在有絲分裂及減數分裂過程中,對染色體的分離扮演了重要的角色。有一個不同的蛋白質複合體,它的功能就好像是一條綁在染色體周圍的繩子,將一對染色體綁在一起(圖四)。在一個特定的訊號出現後,APC 會在一個"降解蛋白質酵素"的抑制劑上貼上標籤,因此這個抑制劑就會被帶到蛋白解體中分解掉,而前述的那個降解蛋白質的酵素就會被釋放出來,在經過活化後將那條綁在染色體周圍的繩子切斷,一但繩子脫落,那一對染色體就會分離。在減數分裂時,錯誤的染色體分裂,是造成孕婦自然流產最常見的原因;一條多出來的人類第 21 號染色體會導致唐氏症;大部份的惡性腫瘤會具有數目改變的染色體,其原因也是由於有絲分裂時錯誤的染色體分裂。

DNA 的修補,癌症以及細胞凋亡

蛋白質 p53 被封為"基因體的守護神",它也是一個腫瘤抑制基因(tumor-suppressor gene),這個意思是只要細胞能製造 p53 就可以阻擋癌症的發生。可以非常確定的,在所有人類癌症中有至少一半的蛋白質是突變的。在一個正常細胞中,蛋白質 p53 一直不斷的被製造和分解,因此其數量是很低的,而它的分解是透過泛素標籤化過程以及負責與 p53 形成複合體的相關 E3 酵素來調控;當 DNA 受到損傷後,蛋白質 p53 會被磷酸化而無法與 E3 酵素結合,p53 的分解無法進行,因此細胞內的 p53 數量迅速增高。蛋白質 p53 的功能是作為一個轉錄因子(transcription factor),換言之就是一個調控某些基因表現的蛋白質。蛋白質 p53 會與控制 DNA 修補以及細胞凋亡的基因結合,並調控該基因,當它的數量升高時會影響細胞週期藉以保留時間給 DNA 修補的運作,倘若這個 DNA 的損傷過於嚴重,計劃性細胞凋亡將會啟動而導致細胞的"自殺"。

人類乳突病毒的感染與子宮頸癌的發生有極大的關聯性,這個病毒避開了 p53 所控制的關卡,它的方法是透過它的蛋白質去活化並改變某一個 E3 酵素(稱為 E6-AP)的辨識行為,E6-AP 被騙去將蛋白質 p53 貼上死亡的標籤而造成 p53 的消失,這個後果是被感染的細胞無法正常的修補其 DNA 所受到的傷害或者引起計劃性細胞凋亡,DNA 突變的數目增加最後終於導致癌症的發生。

免疫與發炎反應

有某一個轉錄因子調控著細胞中許多與免疫防禦及發炎反應有關的重要基因,這個蛋白質,亦即這個轉錄因子,在細胞質中是與一個抑制蛋白質結合在一起的,在這個結合的狀態下,此一轉錄因子是沒有活性的。當細胞暴露到病毒時或有其它的訊號物質出現時,這個抑制蛋白質就會被磷酸化,接著被貼上銷毀的標籤而送到蛋白解體中分解掉,此時被釋放出來的轉錄因子被運送到細胞核中,在那裡它與某些特定的基因結合,進而啟動這些基因的表現。

免疫防禦系統中,被病毒感染的細胞,會利用泛素-蛋白解體系統,將病毒蛋白質降解到適當大小的多肽,這些多肽會被呈獻到細胞的表面。T 淋巴細胞會辨識這些多肽然後攻擊這些細胞,這是我們的免疫系統對抗病毒感染的一項重要防禦方式。

纖維囊腫症(cystic fibrosis)

一個稱為纖維囊腫症的遺傳疾病,簡稱 CF,是由一種不具功能的細胞膜氯離子通道(稱為 CFTR;纖維囊腫跨膜通道傳導調節蛋白)所造成。大部份的纖維囊腫病患都具有一個相同的基因損傷,也就是一個在 CFTR 蛋白質上缺少了一個苯丙胺酸的胺基酸。這個突變導致了這個蛋白質的錯誤摺疊結構,使得該錯誤摺疊蛋白被保留在細胞的蛋白質品管系統中,這個品管系統要確實的將此一錯誤摺疊的蛋白質透過泛素-蛋白解體系統銷毀,而不能將之傳送到細胞膜上,一個沒有正常氯離子通道的細胞將無法透過細胞膜傳送氯離子,這就影響到肺部以及一些其它組織的分泌系統,造成肺黏膜液的增加而破壞其功能,更大幅的增加其受到感染的危險性。

這個泛素系統已經成為一個很有趣的研究領域,可用來發展治療各種疾病的藥物,在此的工作方向可以利用泛素所媒介的蛋白質分解機制去避免某些特定蛋白質的分解,也可以設計成讓這個系統將某一個不想要的蛋白質清除。已經有一個在進行臨床實驗的藥,那是一個稱為 Velcade(PS341)的蛋白解體抑制劑,可以用來醫治多重性骨髓瘤(multiple myeloma),這是一種會影響體內製造抗原的細胞的一種癌症。

今年的得獎者從分子的基礎上解釋了一個對高等細胞而言極為重要的蛋白質控制系統,由泛素所媒介的蛋白質分解機制所控制的細胞功能,現在一直不斷的有新的發現,而這方面的研究也在世界各地無數的實驗室中進行著。

參考資料

這份文章是譯自諾貝爾獎委員會公佈給大眾的閱讀資料:

http://nobelprize.org/chemistry/laureates/2004/public.html

有意進一步的瞭解就得詳讀以下資訊:

http://nobelprize.org/chemistry/laureates/2004/adv.html

原文附有一個很精采的動畫,對這個蛋白質控制系統有畫龍點睛之妙,推薦各位看看:

http://nobelprize.org/chemistry/laureates/2004/animation.html

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諾貝爾化學獎譯文_96
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「諾貝爾化學獎專題」系列文章,為臺大化學系名譽教授蔡蘊明等譯者,依諾貝爾化學獎委員會的新聞稿編譯而成。泛科學獲得蔡蘊明老師授權,將多年來的編譯文章收錄於此。 原文請參見:諾貝爾化學獎專題系列