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有批蛋白質好便宜的?想說這句話你需要一座「蟲蟲生物工廠」——《科學月刊》

科學月刊_96
・2021/09/15 ・4484字 ・閱讀時間約 9 分鐘
  • 作者/林家揚|臺大昆蟲學系碩士生。
  • 作者/林鈺淳|臺大昆蟲學系博士生。
  • 作者/吳岳隆|臺大昆蟲學系副教授。
  • 作者/黃榮南|臺大昆蟲學系教授。

Take Home Message

為了大規模生產出我們想要的蛋白質,以製造出疫苗、蛋白質藥物、保養品等產品,目前已有許多方式能進行蛋白質表現。而昆蟲表現系統在細胞培養的成本低,且其蛋白質轉譯後修飾系統和真核生物比較接近,使其具有生產上的優勢,但它還是難以供應大量市場需求。

若能直接把昆蟲當作生產蛋白質的工廠,利用病毒感染蟲體後,再從蟲體的體液中回收蛋白質,便能提高產量、降低生產成本,而這也是所謂「生物工廠」的概念。

嚴寒的冬季往往是許多病毒歡樂肆虐的嘉年華,狡猾的它們趁著天氣寒冷、人們免疫力下降時趁虛而入,並在人體內引起如發燒、咳嗽、流鼻水等症狀。為了避免這樣的情況發生,許多人選擇施打疫苗以抵抗這些病毒,但是我們該如何快速生產這麼多疫苗來供應所有需求? 

傳統疫苗大多由蛋白質組成,而且需求量極高。因此需要一個能夠大規模生產、效率夠高,同時成本較低的蛋白質生產模式,而此生產模式也可以應用在其他和蛋白質相關的產品上,例如蛋白質藥物或保養品等,不過有哪種生產模式能符合這麼多要求呢?

哪些方法能製造出想要的蛋白質?

你第一個想到的也許是基因改造生物(genetically modified organism, GMO,簡稱基改生物),只要靠著修改生物的基因序列,便能替我們生產出需要的蛋白質。雖然這是一種可行的方式,不過以大規模生產的角度來說卻不可行,因為創造基改生物並非一朝一夕就能達成,從完整的生物個體層級來看也是非常困難的事情,更牽涉到生物體內各式各樣的生物系統。

也許我們修改的基因會對生物造成負面影響;又或是修改的基因序列表現量不佳,無法工業化大規模生產,這些潛在因素都可能使得修改基因序列難以成功且無法預測。此外,創造基改生物的成本高昂,以表現特定蛋白質來說,投資基改生物所需的時間和成本並不符合效益。

隨著科技進步,我們目前已經有更多選擇能進行蛋白質表現,包括大腸桿菌表現系統、酵母菌表現系統、昆蟲表現系統、哺乳動物表現系統等(圖一)。由於真核生物(eukaryote)和原核生物(prokaryote)的蛋白質轉譯後修飾(post-translational modification)有所差異,因此大部分會將大腸桿菌和酵母菌的表現系統,應用在原核生物的蛋白質表現;而昆蟲和哺乳動物的表現系統,則應用在真核生物的蛋白質表現。雖然酵母菌是真核生物,但因為其蛋白質轉譯後修飾系統和原核生物比較接近,所以大多還是使用在原核生物的蛋白質表現,那麼我們要如何選擇這幾個表現系統? 

圖一:四種不同的蛋白質表現系統

真核生物和原核生物的蛋白質轉譯後修飾不同,因此大部分會將大腸桿菌和酵母菌的表現系統,應用在原核生物的蛋白質表現;而昆蟲和哺乳動物的表現系統,則應用在真核生物的蛋白質表現。雖然酵母菌是真核生物,但因為其蛋白質轉譯後修飾系統和原核生物比較接近,所以大多還是使用於原核生物的蛋白質表現。圖/Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH, Public Domain, Wikimedia Commons; 123RF; Photo by Andrew Claypool on Unsplash; 123RF)

若是從人類的角度來看,由於人類屬於真核生物,我們該選擇的不是昆蟲表現系統,就是哺乳動物表現系統。而這兩個表現系統又以昆蟲更勝一籌,在大規模生產的考量之下,昆蟲的表現系統在細胞培養的成本遠低於哺乳動物。哺乳動物的細胞培養需要非常多精密又昂貴的儀器和消耗品,例如能控制溫度和二氧化碳濃度的恆溫箱及細胞培養液,使得培養哺乳動物細胞的條件變得非常嚴苛。

由於生產過程的高成本,若想利用哺乳動物的表現系統大量生產蛋白質,便會有一定的困難度,更不用說哺乳動物系統不管是在細胞層級,還是生物個體等,大多都有法規上的問題,這些因素造就昆蟲表現系統在生產上的優勢。

用「病毒」製造出我們要的蛋白質吧!

既然如此,究竟要如何利用昆蟲來大量製造特定的蛋白質呢?答案其實很簡單,就是「病毒」。

病毒在感染寄主細胞後,能夠用寄主細胞內的資源來表現自己的基因,因此只要將病毒基因中的一部分序列,修改成我們想要的目標蛋白質序列,就能藉由病毒製造出特定蛋白質。也因此,「選擇何種病毒」是昆蟲表現系統中的關鍵,這個病毒必須具備能大量表現特定基因的能力,而且其宿主細胞也必須容易培養,這樣才能將產量提升到最高。而在這麼多種的病毒中,能滿足這麼多條件的就只有「桿狀病毒」(baculovirus)了。

目前在昆蟲表現系統上,最被廣泛使用的桿狀病毒是加州苜蓿夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV),屬於桿狀病毒科的一員,是一種雙股 DNA 病毒。核多角體病毒(nucleopolyhedrovirus, NPV)能感染多種鱗翅目(Lepidoptera)幼蟲,例如蝴蝶、飛蛾類幼蟲,而且在病毒感染蟲體後,會產生一種由「多角體蛋白」組成的結構,稱為「包涵體」(inclusion body)。

我們可把包涵體想像為一個用來包裹病毒的堅硬外殼,不只能保護病毒不受到外界傷害,甚至還可以讓病毒在自然環境中存續一年以上。這些能力讓它成為一種具有防治潛力的生物農藥,能以不使用化學農藥的方式控制蟲害。核多角體病毒的感染途徑從鱗翅目幼蟲的口器開始,當幼蟲取食到含有包涵體病毒的葉片後,包涵體就會順著幼蟲的食道進入其體內,到達中腸後,包涵體的多角體蛋白結構會被幼蟲中腸裡的鹼性腸液分解,並釋放出病毒粒子。

由於病毒粒子非常細小,直徑只有 250~300 奈米(nm),寬度也只有 30~60 奈米,可以直接穿過幼蟲中腸的圍食膜(peritrophic membrane)〔註〕;當病毒粒子穿過圍食膜後,會和中腸的上皮細胞接觸並發生膜融合。此時,病毒的蛋白質外殼會在細胞內被分解,而病毒 DNA 則會被送入細胞核中,開始製造出芽型態的病毒(budded virus),這些出芽型態的病毒會在細胞裂解後進入血體腔(hemocoel)內,進一步感染其他組織和細胞,造成二次感染(圖二)。在感染階段的晚期,病毒會大量表現多角體蛋白並組裝成包涵體,在蟲體死亡後釋出到環境中,因此多角體蛋白結構正是昆蟲表現系統中的關鍵。

圖二:核多角體病毒的感染機制

該怎麼做出目標蛋白質?

由於多角體蛋白會在病毒感染晚期大量表現,所以只要將多角體蛋白序列換成目標蛋白質序列,就能靠著核多角體病毒大量製造出我們想要的蛋白質。這個概念聽起來非常簡單,不過步驟卻有些複雜。

首先,需要準備一個複製載體(cloning vector)和一個轉移載體(transfer vector),複製載體裡含有我們要插入的蛋白質基因序列,並藉由聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)或是大腸桿菌培養的方式來大量複製;轉移載體則含有多角體蛋白的啟動子(polyhedrin promoter)和一個外來基因的插入位置(multi-cloning site)。之後再利用限制酶(restriction enzyme)和連接酶(ligase),我們便可以將目標基因序列插入轉移載體中,形成重組轉移載體(recombinant transfer vector)。

第二步要準備切除處理過,呈現線狀的桿狀病毒 DNA。由於切除處理過的病毒 DNA 不具活性,因此不會影響接下來轉染(transfection)細胞的步驟;此外,因為它們可能也會被細胞攝入,感染與生成不含有目標序列的野生型病毒,因此先行去除病毒活性對實驗成功率來說相當重要。

最後一個步驟是轉染,將桿狀病毒 DNA 和重組轉移載體一同加進培養好的細胞中。由於重組轉移載體上有桿狀病毒的同源基因(homologous genes),所以當細胞攝入重組轉移載體和桿狀病毒 DNA 後,兩者會發生同源重組(homologous recombination),使得轉移載體上含有目標序列的同源片段,與桿狀病毒 DNA 上同源的位置互換,形成含有目標序列的桿狀病毒,也就是重組桿狀病毒(recombinant baculovirus)。這些重組桿狀病毒便會開始感染細胞,並表現出我們想要的蛋白質(圖三)。

圖三:桿狀病毒表現蛋白質的步驟

❶準備複製載體和轉移載體,複製載體裡含有要插入的目標基因序列,再以聚合酶鏈鎖反應或大腸桿菌培養大量複製;轉移載體含有多角體蛋白的啟動子,和外來基因的插入位置。之後利用限制酶和連接酶,將目標基因序列插入轉移載體中,形成重組轉移載體。

❷準備切除處理過線狀的桿狀病毒 DNA。

❸將桿狀病毒 DNA 和重組轉移載體一同加進培養好的細胞中。由於重組轉移載體上有桿狀病毒的同源基因,當細胞攝入重組轉移載體和桿狀病毒 DNA 後,兩者會發生同源重組,使得轉移載體上含有目標序列的同源片段,與桿狀病毒 DNA 上同源的位置互換,形成含有目標序列的桿狀病毒,也就是重組桿狀病毒。這些重組桿狀病毒便會開始感染細胞,並表現出我們想要的蛋白質。

將昆蟲當做「生物工廠」?

以目前桿狀病毒的發展來說,不論生產成本、速度還是生產線建立的難易度,都比哺乳動物的表現系統優勢很多,然而它還是難以供應大量的市場需求。利用昆蟲細胞生產蛋白質依然有一定的成本,若想擴大細胞培養系統也不容易,那如果我們使用整隻昆蟲進行蛋白質生產呢?利用病毒感染蟲體後,再從蟲體的體液中回收這些蛋白質,這樣是否能提高產量、同時降低生產成本呢?

其實這就是所謂「生物工廠」的概念,也就是直接把昆蟲當作我們生產蛋白質的工廠(圖四)。和細胞相比,昆蟲在培養上更加簡單,操作也更為容易,不像細胞需要特別注意有無汙染的情況,也不需要無菌操作台、細胞培養液、恆溫箱,以及提供細胞生長因子的胎牛血清(fetal bovine sera, FBS)等昂貴設備和耗材。以鱗翅目幼蟲的寄主來說,只需要透氣的塑膠容器和人工飼料就可以培養,而這些東西的成本都遠低於細胞所需,加上一隻幼蟲個體所含有的細胞數量也遠超過一個細胞培養皿,使得生物工廠這個概念成為昆蟲表現系統的一個新方向。

以真核生物或是人類需要的蛋白質來說,昆蟲表現系統具有許多哺乳動物的表現系統所沒有的優勢。以桿狀病毒感染昆蟲寄主、從而表現特定蛋白質的方式,不僅成本低、產量高、不受法規上的限制,也更容易設計出產業上的供應鏈,若是有真核生物蛋白質的需求,不妨考慮看看昆蟲表現系統吧!

圖四:利用蟲體作為生物工廠

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註解

  • 〔註1〕圍食膜是一種在昆蟲中腸裡,用來保護腸壁細胞的膜狀結構,有如人類腸胃中的黏膜。
  • 科學月刊/在一個資訊不值錢的時代中,試圖緊握那知識餘溫外,也不忘科學事實和自由價值至上的科普雜誌。

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非營利性質的《科學月刊》創刊於1970年,自創刊以來始終致力於科學普及工作;我們相信,提供一份正確而完整的科學知識,就是回饋給讀者最好的品質保證。

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「駝背、變矮、下背痛」是骨質疏鬆警訊!及早治療以免骨折造成失能

careonline_96
・2021/09/21 ・2705字 ・閱讀時間約 5 分鐘
駝背、變矮、下背痛,當心骨質疏鬆警訊,以免骨折害性命!骨科醫師圖文解析

李女士是活動力很好的人,到了六十多歲依舊忙進忙出。這天她如往常般彎腰搬起一個箱子時,突然感到背部劇痛,整個人跌坐在地,完全站不起身,最後只能在救護人員的協助下抵達急診室。

「聽完病人的描述,我們大概就可以猜到是因為骨質疏鬆,彎腰搬重物所造成的脊椎骨骨折。」義大醫院骨科部脊椎科楊士階醫師表示,「骨質疏鬆患者因為彎腰搬重物所導致的脊椎骨折比較常發生在胸腰椎交界的地方,若是在滑倒時用手去撐地,可能骨折的部位是手腕關節,或是髖關節的股骨頸。」

骨質疏鬆症是全身性骨骼疾病,會在無聲無息中逐漸惡化,倘若沒有接受檢查,患者大多沒有自覺,楊士階醫師說,很多患者都是在骨折突然發生時才發現嚴重骨質疏鬆。

骨質疏鬆本身雖然不會致命,但是在骨折之後,患者可能被迫臥床且疼痛難耐,生活品質大受影響,各種併發症也會接踵而至。根據統計,髖部骨折患者一年內的平均死亡率高達 22% [1],對中老年人而言,是不容忽視的健康威脅。

此外,在骨折之後,患者可能會失能,甚至得完全仰賴他人照顧,為個人及家庭帶來沉重的負擔。

台灣人口逐漸高齡化,楊士階醫師強調,及早發現、積極治療,才能預防骨質疏鬆症造成的危害。

三項自我檢查,及早發現骨質疏鬆

骨質疏鬆症常發生在停經後的婦女,大概五十多歲,楊士階醫師指出,不過較高齡的老人大概六十五歲以後不管男性、女性都有可能出現骨質疏鬆。2005〜2008 年國民營養調查報告指出台灣 50 歲以上男性與女性,以雙能量 X 光吸光式測定儀檢測骨鬆症,分別為 23.9% 及 38.3% [2]。

我們可以替自己或家人先做個簡單的評估,如果有駝背現象、身高變矮 4 公分以上、常常感到下背疼痛,就要懷疑有骨質疏鬆的問題。

骨質疏鬆警訊要注意

年紀較大或出現骨質疏鬆警訊的民眾,務必盡快就醫,楊士階醫師說,檢查骨質密度可以利用定量超音波骨密度檢查儀或雙能量 X 光吸光式測定儀(dual-energy X ray Absorptiometry,DXA),超音波檢查的速度較快、便利性高、沒有侵入性,X 光檢查的準確度較高,能夠針對脊椎與髖關節進行掃描,檢查時間大約 15〜20 分鐘。

骨密度檢查的報告會標示 T 值(T-Score):

  • 當 T 值大於或等於 -1.0 時屬於「正常」
  • 當 T 值介於 -1.0 至 -2.5 之間稱為「骨質缺乏(osteopenia)」
  • 當 T 值等於或小於 -2.5 時,稱為「骨質疏鬆症(osteoporosis)」。
  • 如果患者已有骨折發生時,稱為「嚴重性骨質疏鬆症」。

運用骨密度檢查我們可以利用較客觀的數據了解骨質的狀況,楊士階醫師說明,如果骨密度檢查屬於骨質缺乏、甚至骨質疏鬆,建議要接受進一步的治療。

國際骨質疏鬆症基金會也有製作骨折風險評估工具(Fracture Risk Assessment Tool,FRAX),填入年齡、性別、體重、身高、骨折病史、父母髖骨骨折病史、抽菸、類固醇使用、股骨頸骨質密度等資料,便能估算未來十年發生骨折的風險。

積極治療骨質疏鬆,預防骨折

我們骨頭中具有造骨細胞與破骨細胞,造骨細胞(Osteoblast)會產生新的骨質,破骨細胞(Osteoclast)則會吸收骨質,讓骨頭一直處在動態平衡的狀態。

楊士階醫師解釋,想要治療骨質疏鬆,可以從這兩個方面著手,抑制破骨細胞或刺激造骨細胞。

抑制破骨細胞的藥物包括雙磷酸鹽、雌激素、選擇性雌激素調節劑、RANKL 單株抗體、抑鈣素等,可以減少骨質被吸收。

刺激造骨細胞的藥物源自人類的副甲狀腺素,可以促進造骨細胞生成骨質,需要每天皮下注射。

積極治療骨質疏鬆

目前還有一類藥物屬於雙重機轉藥物,能夠降低破骨細胞的骨質吸收作用,且能增加造骨細胞的骨質生成作用,有助降低骨質疏鬆患者發生骨折的機率。接受骨質疏鬆治療時,請記得每天要補充鈣質與維生素 D。

預防骨質疏鬆,可以這樣做

隨著年紀增加,骨質會持續流失,我們要從年經時便增高最大顛峰骨量,預防骨質疏鬆,楊士階醫師說,日常生活中請盡量減少骨質疏鬆的危險因子,包括戒菸、戒酒,也要減少咖啡因的攝取。

每天攝取足量的鈣質與維生素 D,有助維持骨骼健康。國際骨質疏鬆症基金會建議,50 歲以上成人每日鈣質攝取量須達1200 毫克,維生素 D 攝取量須達 800 至 1000 IU 國際單位(international units,IU)[2]。

鈣質必須由食物中獲得,富含鈣質的食物包括乳製品、豆類、深綠色蔬菜、海帶、香菇、堅果、芝麻等。

接受日照後,身體可以合成維生素 D,每天要適度接受日照,食物方面可選擇牛奶、起司、蛋黃、海水魚、淡水魚、蕈菇、黑木耳等。

倘若無法由食物中攝取足量鈣質與維生素 D,便可適度補充。

預防骨質疏鬆,可以這樣做

負重運動有助增加骨質密度,肌力足夠也能改善平衡、減少跌倒及骨折風險。從年輕便養成規律運動的習慣,好處多多!

貼心小提醒

骨質疏鬆是每個人都可能遭遇的問題,由於骨質流失時通常沒有明顯感覺,很多患者都是在骨折發生後,才驚覺患有骨質疏鬆症,楊士階醫師叮嚀,如果具有危險因子,如年紀較大、抽菸、飲酒過量等,或是觀察到有駝背現象、身高變矮 4 公分以上、常常感到下背疼痛,建議就醫接受骨質密度檢查。
如果有骨質缺乏、甚至骨質疏鬆的狀況,務必定期追蹤並積極接受治療,以降低骨折及其他併發症發生的機會!

本衛教文章由台灣安進協助刊登

參考資料

  1. Downey C, Kelly M, Quinlan JF. Changing trends in the mortality rate at 1-year post hip fracture – a systematic review. World J Orthop. 2019;10(3):166-175. Published 2019 Mar 18. doi:10.5312/wjo.v10.i3.166
  2. 2020台灣成人骨質疏鬆症防治之共識及指引

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