還在慢慢判定菌種？讓微生物鑑定儀幫你一把！

2019/03/28 |

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施朝仁／財團法人食品工業發展研究所／生物資源保存及研究中心研究員

「我是誰？」微生物百百款，要如何鑑定？

對所有微生物研究的從業人員而言，無論是在學界、業界抑或是醫界，精確的微生物身份判定或鑑定，一直都是最重要的事情。

在學界，正確的菌種鑑定關係著研究生能不能順利畢業、教授的論文能不能發表；在業界，微生物產品中菌的正確性則關係著普羅大眾的健康與權益；在醫界，精確的菌種鑑別，更是影響醫生能否正確下藥，是攸關生死的重大任務。

傳統微生物的鑑定方法建立於形態觀察及生理生化反應的基礎上。

形態觀察不外乎菌長的圓還是扁？長還是短？有無鞭毛？會不會產生內孢子？革蘭氏染色是紅還是藍？菌落形態是濕潤隆起或是乾扁皺縮等等。生理反應要看菌的厭氧性、生長溫度、生長酸鹼值、耐鹽程度等。生化反應則是看對碳源的利用、碳水化合物的氧化或發酵、酵素反應等等。然而，這些檢測所謂的表現型特性 (phenotype) 的觀察或試驗，往往費時且耗工，甚至不一定精確。

傳統微生物的鑑定方法建立於形態觀察及生理生化反應的基礎上。圖／pixabay

時代在走，進步要有：微生物鑑定儀歷代演進

因應著科研人員對「快速」、「可靠」的渴望與需求，微生物鑑定平台也跟著快速演進中，更快、更準的套組與儀器不斷地推陳出新。以生化反應偵測為例，Biomerieux 公司在 1970 年代推出的 API ® 鑑定產品堪稱全球最早開發的手工微生物鑑定系統。

這套系統將繁複的零散生化試劑融合成套裝式組合，曾被視為微生物領域中的黃金標準鑑定法，被廣泛運用在各領域當中，整個系統大約涵蓋 600 多種菌株，所需的鑑定時間只要 18-72 小時。

然而，他畢竟還是 『手工套組』，操作時的試劑添加、結果判讀都還是得自己來。

API® 鑑定系統。圖／作者提供

於是另有廠商推出了半自動的鑑定系統，如 BiOLOG 公司推出的 MicroStation 微生物菌種鑑定系統，只要手動添加菌液到 96 孔樣本盤，反應結果就交由機器判讀、比對。這套系統可鑑定的菌株範圍更廣，多達 2500 種。

BiOLOG MicroStation 微生物菌種鑑定系統。圖／作者提供

有了半自動系統後，當然就會有廠商研發全自動系統，Biomerieux 公司繼 API ® 系統後，再接再厲推出全自動微生物分析系統 Vitek 2 Compact，強調只要備妥菌液，機器就可以自動將菌液吸入測試卡內，在含有不同試劑的小反應槽裡進行反應，腸內桿菌最快 2-6 小時即可判定身份。

Vitek 2 微生物鑑定系統。圖／作者提供

上述這些鑑定方式，都是根據微生物的表現型來進行判定，然而隨著分子生物技術的快速進步，基於微生物基因型的分類方法發展得如火如荼。不管是利用細菌的 16S RNA 基因序列，或是真菌的 18S RNA 基因序列，只要能取得目標微生物的 DNA，經過簡單的聚合酶連鎖反應 (PCR) 及定序反應就能獲得菌種的 DNA 序列。

也因此，線上基因序列資料庫的資料正以每日數以萬計的數量快速累積中。根據這些序列，生物資訊專家可快速的將各個微生物樣品進行比對分類，甚至畫出他們的系統演化樹圖。微生物學家只要將手上未知菌種的 16S 或18S rRNA 基因的序列與資料庫進行比對，很快地就能得到最接近的菌名，而且多數菌種的身份判定能精確到連同種不同品系都鑑定得出來。於是，現在的微生物從業人員，遇到未知菌株，第一個反應就是定序。至此，微生物鑑定平台正式進入了基因型的時代。

別再蝦等了，2小時內菌種鑑定迅速搞定

而隨著定序繼續的突飛猛進，尤其次世代定序儀的發展，更將微生物鑑定帶入另一個境地：不用純菌也不用活菌就可了解全菌組成的宏觀基因體世代 (metagenomics)。

不過這不是此篇重點，表過就好。對微生物生態學家、醫院微生物檢驗人員或食品、藥廠環境監控人員而言，每天所面對的絕對不會是簡單、少數幾株菌的鑑定工作，往往一次就是數百甚至上千個未知菌落。即使你的老闆很有錢，可以很豪邁地把全部的未知菌落（菌液）通通送去做定序，但別忘了還要先一個一個抽 DNA、跑 PCR、跑電泳確認增幅片段等等的工作得先進行，就算實驗室裡有錢到可以將上述工作都以全自動設備代勞，「時間」仍是無法避免的成本。

解決的方法就是基質輔助雷射脫附游離飛行時間式質譜儀，以下簡稱 MALDI-TOF MS ，這項技術近年已被廣泛應用在微生物鑑定與研究上。此儀器的原理為：

將樣品與基質（通常為有機酸）混合，以鐳射光激發樣品，讓樣品氣化游離後，飛行至偵測器，系統再將樣品中所有蛋白質、胜肽、代謝物等依質量大小以圖譜呈現。

這就像是要分析一個班級（細胞）的學生體重（全細胞蛋白質）組成，讓學生穿上感應槍聲會強迫起跑的特定衣物（基質），並排站於起跑線（樣本盤），鳴槍（雷射激發）後起跑。學生裡體重輕的跑得快，體重重的跑得慢，裁判在終點線依抵達順序將學生排序，排列於司令台（圖譜），則可得到該班級學生體重組成（蛋白質指紋圖譜）。

MALDI-TOF MS 解析微生物的全細胞蛋白質分子量大小範圍在 2000-20000 Da 之間，此區間的蛋白質以核醣體蛋白等胞內負責持家的蛋白質為主⁴。核糖體蛋白在不同菌種都需要用到且需求量相當，所以不易受到外在培養條件影響，故質譜訊號有良好重複性與再現性，可作為菌種鑑別之依據。MALDI-TOF MS 設備的製造商已與德國菌種中心合作，將已知菌株的蛋白質指紋圖譜建立資料庫，利用相同物種指紋圖譜一致的特性，將未知樣本圖譜與已知圖譜比對，則可快速完成微生物身分鑑定。

MALDI-TOF MS 系統。圖／作者提供

對於一般微生物而言，其解析度已能達到「種」層次的鑑別，甚至是近緣物種之區分，因而被認為具有取代細菌 16S rRNA 基因定序比對之潛力^1,2,3。MALDI-TOF MS 技術比對菌株細胞裡的多種蛋白質，而 16S/18S rRNA 基因的比對只用一個基因為代表。想像要區分兩個班級的特色差異，分析全班同學的體重組成，似乎比只抓班長出來比較身高體重來的宏觀一些。

利用 MALDI-TOF MS 進行微生物分類鑑別最大優勢在於時間成本的降低。只要將欲分析的菌落直接塗抹於樣本盤，覆以特定基質即可，而且每個樣品盤可同時處理 96 個樣品，上機後 2 小時內即可完成所有分析。每一個樣品點所需使用的試劑耗材花費低於百元新台幣，相較於前述的手動微生物鑑定套組－API® 與半自動－BiOLOG 或全自動鑑定系統－Vitek 2，甚至是 16S rRNA 基因序列分析，在操作上更加簡便且成本更低，因此非常適用於短時間內進行大量樣品之快速分群鑑別分析。想做菌種鑑定，你不用再苦等生化反應與定序結果了，試試 MALDI-TOF MS吧！

參考文獻

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