小小RNA立大功 – mir17~92 扮演維持運動神經元之存活關鍵

本文轉載自顯微觀點

科學界的重大盛事－諾貝爾獎，已在 10 月揭曉。今（2024）年生醫獎頒發給維克托．安布羅斯（Victor Ambros）和加里．魯夫昆（Gary Ruvkun），他們以「發現 microRNA 及其在轉錄後基因調控中的作用」獲肯定得到桂冠。而這項重大發現的背後，一種叫做「秀麗隱桿線蟲」（C. elegans）的小蟲子居功厥偉。

生醫獎背後大功臣

安布羅斯和魯夫昆對於基因如何受到調控，如何因活化時間不同而確保各類型細胞在正確時間點發育的問題很感興趣。因此他們研究因基因活化出現問題的兩種線蟲突變株：lin-4 和 lin-14，以瞭解當中的機制。

一開始，安布羅斯先發現 lin-4 基因似乎是 lin-14 基因的負調節因子，但 lin-14 的活性是怎麼被阻斷的，仍然是個謎。因此他系統性地找尋 lin-4 在基因體中的位置與基因序列，也因此意外發現 lin-4 基因只會產生一種異常短、不足以合成蛋白質的核醣核酸分子。

同一時間，魯夫昆在麻州總醫院和哈佛醫學院新成立的實驗室研究 lin-14 基因的調控。魯夫昆發現 lin-4 抑制的並不是 lin-14 的產生，而是抑制 lin-14 基因產生蛋白質，且發生在基因表現過程的後期。實驗也顯示要抑制 lin-4，必須要有 lin-14 訊息核醣核酸（mRNA）中的一個片段。

安布羅斯和魯夫昆比較了各自的實驗成果，找到突破性的發現：lin-4 部分序列與 lin-14 訊息核醣核酸的關鍵片段中的序列互補。他們進一步實驗，顯示 lin-4 微型核醣核酸（microRNA）透過與 lin-14 訊息核醣核酸中的互補序列結合，來抑制 lin-14 轉譯，進而阻斷 lin-14 蛋白質的產生，也因此揭開 microRNA 介導的基因調控新原理。

這項結果被發表在 1993 年的《細胞》期刊的兩篇文章上。但一開始這樣的基因調控機制被認為是秀麗隱桿線蟲所特有，而不受重視。直到 2000 年，魯夫昆的研究團隊發現了另一種由 let-7基因編碼的 microRNA，科學界的態度才發生變化；因為 let-7 基因高度保存在整個動物界中。

接下來的幾年裡，數百種不同的 microRNA 被鑑定出來，微型核醣核酸的基因調控在多細胞生物中普遍存在；而基因調控若失常，則可能導致糖尿病、癌症或自體免疫疾病。

這不是秀麗隱桿線蟲第一次「助攻得獎」。

成為助攻王的關鍵

2002 年西德尼．布瑞納（Sydney Brenner）、約翰．蘇爾斯頓（John Sulston）和羅伯特．霍維茨（Robert Horvitz）便是從秀麗隱桿線蟲的研究「發現器官發育和計畫性細胞死亡的遺傳調控機理」，進而獲得該年諾貝爾生醫獎。值得一提的是，今年的兩位得主都曾是霍維茨實驗室的博士後研究員。

除此之外，2006 年諾貝爾生理醫學獎也頒給研究線蟲的美國科學家安德魯．法厄（Andrew Zachary Fire）和 克雷格．梅洛（Craig Cameron Mello），以表彰他們「發現 RNA 干擾—雙鏈 RNA 引發的沉默現象」。甚至馬丁．查菲（Martin Chalfie）也利用秀麗隱桿線蟲的觸感接受器神經元「發現並改造綠色螢光蛋白（GFP）」獲得 2008 年諾貝爾化學獎。

秀麗隱桿線蟲為何能成為諾貝爾的「助攻王」呢？布瑞納曾在他的論文中提到：「線蟲適合做基因研究，並且其神經系統可以被精準確定。」他在 1963 年提出以秀麗隱桿線蟲作為模式生物，並於 1974 年發表其在發育生物學和神經科學的成果。

秀麗隱桿線蟲是第一種完成全基因組定序的多細胞生物。加上體積小、成蟲約長1公釐，以及透明且易於獲取的遺傳物質，使其成為絕佳的模式生物。

其在室溫下大約三天可以從卵生長為可受精的成蟲，在實驗室中以大腸桿菌為食，易於大量培養。並且解凍之後仍能存活，因此適合長時間儲存。加上每隻成蟲可產生約 300 隻後代，適合作遺傳學研究。

易於觀察也是秀麗隱桿線蟲作為絕佳模式生物的關鍵因素。由於細胞譜系固定，研究人員可以使用微分干涉顯微鏡（DIC）觀察每一個細胞的發展，甚至在在螢光蛋白出現之前，就有從受精卵到成體完整細胞譜系的描述。

在線蟲研究的多個工作步驟中，立體、複式或共軛焦顯微鏡都是常見的工具，以符合不同實驗要求。且隨著顯微技術的發展，秀麗隱桿線蟲在發育生物學中的應用和研究也更加多元。

隨技術發展 研究面向更多元

在挑選合適的線蟲並準備進行遺傳或生化分析的「採蟲」階段，通常會使用末端黏有睫毛的木棍，在立體顯微鏡下關、挑選。然後使用倒立顯微鏡以顯微注射對線蟲性腺進行基因改造。

螢光蛋白（FP）是在線蟲中進行分子和細胞行為研究的核心工具，螢光顯微技術廣泛用於線蟲研究，例如 GFP 及其改進版本（如mScarlet和mCherry）常用於標記和追蹤蛋白質的動態過程。

螢光蛋白也可使用於研究線蟲的染色體外陣列表現或穩定整合到基因組中。現在則有許多研究者使用 CRISPR（基因編輯）技術，將螢光標記穩定地整合到基因組中，這樣可以精確追蹤特定蛋白在細胞內的表現位置和強度。

層光顯微術（Lightsheet microscopy）則可以在不壓縮樣本的情況下，提供更高的空間和時間解析度，特別適合長期追踪線蟲胚胎發育過程。

除此之外，因為秀麗隱桿線蟲是截至 2019 年唯一一個完成連接體（connectome，神經元連接）測定的生物體，因此一直以來也常被作為神經科學研究的模式生物。

研究者可利用螢光蛋白（如 GCaMP）來追蹤鈣離子濃度的變化，當鈣離子濃度上升時會發出更強的螢光，再透過螢光強度來分析神經系統在睡眠、運動等各種行為時的活動模式。或是進一步利用轉盤式共軛焦顯微鏡、雙光子顯微鏡，抑或結合更強大的影像分析工具，對神經元活動成像並藉此解讀不同行為背後的神經迴路機制

作為模式生物，秀麗隱桿線蟲因為基因組簡單、細胞譜系固定且神經結構已知，為揭示基因調控、細胞發育、神經行為等生物學問題提供了清晰的研究途徑，在生物學研究中佔有重要地位。

儘管已是諾貝爾獎「助攻王」，相信隨著顯微和基因編輯技術的快速發展，秀麗隱桿線蟲仍能在探索人類疾病模型、藥物篩選及再生醫學等應用領域，引領研究新方向。

• 諾貝爾官網：新聞稿
• Breimann, L., Preusser, F., & Preibisch, S. (2019). Light-microscopy methods in C. elegans research. Current Opinion in Systems Biology, 13, 82-92. 
• Studying Caenorhabditis elegans (C. elegans)

※另感謝台灣科技媒體中心（SMC）舉辦諾貝爾獎解析記者會

想像一下你跟爸媽坐在客廳沙發上，突然，一個閃電雷劈秒停電！這時候，你和你爸媽一定會有一樣的反應：整個人嚇傻在原地不動，然後才慢慢移動去找手電筒在哪裡。

當我們受到驚嚇的時候，為什麼會整個人暫時僵住、動彈不得？哥倫比亞大學祖克曼心智、腦與行為研究中心的理查·曼 (Richard Mann) 博士會說：「這可跟血清素脫離不了關係！(*´∀`)~♥」

設計突發的環境刺激：突然關燈、突然地震

一般來說，我們比較常聽到大腦中的血清素濃度跟「調節心情和認知功能」有關：大腦中的血清素濃度低，跟憂鬱情緒、記憶力衰退有所關聯。不過今天我們不是要討論「大腦」中的血清素濃度，過去研究就有指出，由「運動神經元」釋放的血清素會影響果蠅和脊椎動物的運動速度。

理查的研究團隊為了要更了解血清素如何影響動物的運動速度，做了一系列的實驗。研究團隊分別把果蠅分成兩組，分別是「關燈組」與「地震組」，讓果蠅經驗到「突然的黑暗」和「地震來了！」的環境刺激。

至於要怎麼製造「果蠅等級」的地震？理查團隊找來了同為哥倫比亞大學祖克曼研究中心的 Tanya Tabachnik 團隊設計、組裝客製化的儀器。他們創造一個非常微小、果蠅 size 的小空間，這個小空間下面裝著特製震動馬達。如此一來，就能夠調整馬達的力道來製造想要的地震規模。

接下來，研究團隊用 FlyWalker 這個由該團隊實驗室開發的 app 來追蹤果蠅的腳步，藉此監控果蠅的移動速度。於此同時，研究團隊也操縱果蠅在腹側神經索 (ventral nerve cord) 負責釋放血清素的神經元的活性。

果蠅的腹側神經索，可以類比到脊椎動物的脊髓。

因為血清素，嚇到就僵住

研究團隊發現，當果蠅經驗到意料之外的環境改變，神經系統會快速釋放血清素，讓身體暫時不動，來應對可能的威脅，並在上個月底發表在《當代生物學》(Current Biology) 期刊。這種「僵住」的行為在很多動物身上都可以看到：從果蠅，到魚，到人類都會。

研究團隊通訊作者理查·曼博士表示：「我們發現當果蠅遇到突發的環境改變而僵住的時候，血清素的功能就像緊急煞車一樣。這是因為血清素的釋放會導致動物兩腿關節變僵硬，進而使動物動彈不得。」

另外，研究團隊也發現，當研究人員激發會釋放血清素的神經元，會讓果蠅的移動速度慢下來；靜默相同的神經元會讓果蠅的移動速度變快。

在僵住之後？其實是為了下一步好好做準備

本文看到這裡，相信你會有跟我一樣的疑問，就是為什麼我們動物要有這樣的機制？嚇到會僵住有什麼好處嗎？

研究的第一作者克萊爾·霍華德說：「我們覺得這是很重要的，這可以讓果蠅蒐集更多跟環境改變有關的訊息，然後決定下一步該怎麼做。」

有趣的是，儘管「突然的黑暗」和「地震來了！」都會讓果蠅嚇到僵住，但在僵住之後的運動速度卻有顯著的差異。克萊爾補充說：「受到突然黑暗的驚嚇之後，果蠅的移動速度變慢且謹慎；不過地震會讓果蠅在僵住之後反而移動得更快！」

細細思考一下，果蠅有這樣的反應差異也算合理：坐在客廳沙發上你和爸媽，在秒停電的傻住之時，也會因為看不到身旁的環境而緩慢移動。

雖然說這項研究成果可能還不能延伸解釋到人類身上，但或許將來有一天，遇到地震的你，除了逃命跟發地震文之外，還可以想起這篇研究！ʕ•̀ω•́ʔ✧

參考資料

1. Howard, C. E., Chen, C. L., Tabachnik, T., Hormigo, R., Ramdya, P., & Mann, R. S. (2019). Serotonergic modulation of walking in Drosophila. Current Biology.
2. Jenkins, T. A., Nguyen, J. C., Polglaze, K. E., & Bertrand, P. P. (2016). Influence of tryptophan and serotonin on mood and cognition with a possible role of the gut-brain axis. Nutrients, 8(1), 56.
3. Why do we freeze when startled? New study in flies points to serotonin. ScienceDaily, 2019.11.27

科學家如何孕育實驗靈感？不只限於實驗室，也能是馬拉松賽場，甚至是和小朋友的交流中！中研院分子生物所的陳俊安團隊，從發育生物學的角度出發，研究運動神經元發育和退化的過程，期望能協助發展漸凍症的精準醫療。

生出健康的小孩理所當然？那一定是沒有讀過發育生物學

每一位讀了發育生物學的人，都會覺得要生出一個健康的小孩有多困難。

要發育一個胚胎，每個成長環節都要被精確地調控，自然界演化出一套模式克服外在的干擾，讓胚胎維持在穩定的狀態，才得以發育成功。發育生物學（Developmental biology）就是在了解基因如何調控細胞生長、分化、產生形態，進而使生物體形成組織和器官。

為什麼想研究「運動神經元」？

之前在英國劍橋大學讀發育生物學博士時，運用「非洲爪蟾」這種模式動物來尋找胚胎裡有什麼重要的基因會影響胚胎發育，例如胚胎的「中胚層」會分化成肌肉和心臟。

在博士班的第一年，我篩選了兩千多個和中胚層有關的基因，一個一個觀察各個基因在胚胎裡的表現。常常一個人作微注射到三更半夜，因為爪蟾胚胎在第一次分裂後注射基因去大量表現，要等六到八小時才會開始發育中胚層。

有時為了能回家跟太太共進晚餐，又不想耽誤實驗的進度，冬天的時候會把胚胎帶回家放在室外，半夜一兩點起來再將胚胎做甲醛固定。因為冬天天氣較冷，室外溫度跟冰箱一樣，可以直接放室外整夜。

我最後選擇一個還沒有被報導過的基因深入研究其功能，這個基因只會在「運動神經元」表現出來，查了很多文獻後發現沒有人研究過這個基因。我覺得很有趣，就一頭栽下去研究運動神經元、直到現在。

我們每天站立的姿勢、行走運動，都是由「運動神經元」調控。藉由了解運動神經元發育的過程，希望了解一些運動神經元疾病發生的原因。我們實驗室比較專注在受精卵發育成胚胎的過程，例如胚胎裡的運動神經元是怎麼建立，但現在有一半人力進入研究運動神經元退化的疾病。

越了解運動神經元如何發育，就越能知道它如何退化。

五年前我從美國回台灣時，因緣際會認識高雄醫學大學副校長──鍾育志醫師（現為交大生科院院長），他也是台灣脊髓肌肉萎縮症（Spinal Muscular Atrophy, 簡稱 SMA ）病友協會的理事長。另外，我們現在的實驗室位置，是接續中研院分生李鴻老師的實驗室空間，全世界第一隻脊髓肌肉萎縮症（SMA）模式小鼠，就是在這裡建立。

李鴻老師過世後，台灣這部分的研究就消失了。彷彿冥冥中有一種機緣，讓我來到中研院分生所這裡，正好我也是研究運動神經元，就和鍾醫師討論如何延續這方面的研究，開始了合作模式。像是建立台灣第一個人類的脊髓肌肉萎縮症（SMA）的 iPSC（誘導性多功能幹細胞），並將它們分化成各式不同的運動神經元亞型（subtype），並研究 SMA 為何只有運動神經元會退化，再尋求看看可能有什麼治療的方式。

今年鍾醫師邀請我參加脊髓肌肉萎縮症病友大會，看到這麼多小朋友因為運動神經元的問題，終生得坐輪椅，覺得很震撼，回來就覺得要更努力找到造成運動神經元疾病的原因。很多研究都是在之後會發現……很多東西一開始都沒想到！這是基礎科學研究有趣的地方，跟轉譯醫學之間沒有衝突，不管從哪邊開始，最後都是相通的。

如何找到實驗靈感？

中研院分子生物所經常邀請國際學者來演講，演講完也會和學生、研究員交流。正好有一次一位國際學者和我們實驗室學生聊天，發現學生們除了研究之外，生活有點無聊，只有看電影、看書、看小說。後來我們就利用實驗室群體的壓力（笑），一起挑戰 21 公里半程馬拉松。

實驗室很多人都沒有跑過馬拉松，成績是一回事，但每個人都跑完了。我們做研究最辛苦的永遠是「最後一哩路」，如果沒有堅持走完，就前功盡棄。藉由這個馬拉松，大家一起堅持、完成的感覺蠻好的。

做實驗時，是什麼感覺？

我以前在中正大學念的是化學系，雖然學習到很多化學知識，但直到在台大生物化學所讀碩士班時，才開始真正在顯微鏡下看到各種化學分子對於生命發育過程的調控，我永遠無法忘記第一次在顯微鏡下看到老鼠精子活動時的震撼。

我熱愛做實驗的過程，這包含所有的實驗，不僅只是實驗室裡的研究。我大女兒出生時，看到那小小的嬰兒，真的很感動。在她出生第一個月，我會透過各種「實驗」來理解她，像是調控吃東西的時間，或是以十二小時為單位開燈關燈、讓房間內白天黑夜的時間變化固定，看看哪種情況下她的表現會最快樂。

我上班開車時也會走不同的路徑，會特別計時比較哪一條路徑最順暢，同一路徑都會走許多次，統計平均值後再尋求最佳途徑。我深信唯有透過科學實驗的精神，才能找出解決問題的最好方式。我喜歡嘗試各種實驗、也不害怕失敗，希望能藉此找到最有趣的研究課題。

會如何向小朋友介紹你的研究？

2016 年中研院舉辦院區開放活動時，我們實驗室第一次嘗試帶著小朋友參觀，當時設計了三個實驗。

第一個是讓小朋友在顯微鏡下觀察自己的頭髮，因為顯微鏡下看到的、和肉眼看到的很不一樣。第二個是將乾冰放在水裡冒泡，並加入會隨著不同酸鹼值變色的化學成分，當乾冰的二氧化碳釋出，水裡的酸鹼值會跟著改變，就會看到乾冰溶液從紅色、變成粉紅色、再變成黃色，如果再加入漂白水就會再變成紫色。

第三個跟我們研究比較相關，是讓小朋友觀察「雞胚」。一般我們吃的是沒有受精的雞蛋，我們跟家禽中心買受精後變成胚胎的蛋，小心把蛋殼剪開可以看到小雞的胚胎，包含心臟的跳動。小朋友可以看到不同期間的胚胎，發育三天、五天、十天，從一開始胚胎很小要用顯微鏡才能看得到，長大到肉眼也看得到。

那時有一個小朋友問說什麼是「受精」，我們就要想一個小朋友會懂的方式來解釋：「就像每個小朋友都是爸爸媽媽受精之後才會有你們，小雞也是一樣，小雞的媽媽要先遇到小雞的爸爸……」。

在我們唸書的年代，大部分都在準備考試，沒有很多機會操作實驗。科學相關的課本只是強背，但透過實驗、眼睛親自看到，記都不用記，那個印象就會烙印在心底。當小朋友看過小雞胚胎，將來讀到生物體的發育時，就會有粗淺的印象。讓小朋友在很早的時間點接觸、產生興趣，未來就有機會投入相關領域。

台灣的小朋友大多比較安靜，就看著你弄、發出驚嘆，對實驗室裡很多東西都很有興趣。除了小朋友，爸媽好像也玩得蠻開心（笑）。

希望有更多機會讓小朋友操作實驗，因為在顯微鏡之下，看見就是相信。

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