鎖定薄層 TIRF 顯微鏡成單分子研究關鍵

本文與  益福生醫 合作，泛科學企劃執行

昨晚，你又在床上翻來覆去、無法入眠了嗎？這或許是現代社會最普遍的深夜共鳴。儘管換了昂貴的乳膠枕、拉上百分之百遮光的窗簾，甚至在腦海中數了幾百隻羊，大腦的那個「睡眠開關」卻彷彿生鏽般卡住。這種渴望休息卻睡不著的過程，讓失眠成了一場耗損身心的極限馬拉松 。

皮質醇：你體內那位「永不熄滅」的深夜警報器

要理解失眠，我們得先認識身體的一套精密防衛系統：下視丘-垂體-腎上腺軸（HPA axis） 。這套系統原本是演化給我們的禮物，讓我們在面對劍齒虎或突如其來的危險時，能迅速進入「戰鬥或快逃」的備戰狀態。當這套系統啟動，腎上腺就會分泌皮質醇 (壓力荷爾蒙)，這種荷爾蒙能調動能量、提高警覺性，讓我們在危機中保持清醒 。

然而，現代人的「劍齒虎」不再是野獸，而是無止盡的專案進度、電子郵件與職場競爭。對於長期處於高壓或高強度工作環境的人們來說，身體的警報系統可能處於一種「切換不掉」的狀態。

在理想的狀態下，人類的生理時鐘像是一場精確的接力賽。入夜後，身體會進入「修復模式」，此時壓力荷爾蒙「皮質醇」的濃度應該降至最低點，讓「睡眠荷爾蒙」褪黑激素（Melatonin）接棒主導。褪黑激素不僅負責傳遞「天黑了」的訊號，它還能抑制腦中負責維持清醒的食慾素（Orexin）神經元，幫助大腦順利關閉覺醒開關。

然而，當壓力介入時，這場接力賽就會變成跑不完的馬拉松賽。研究指出，長期的高壓環境會導致 HPA 軸過度活化，使得夜間皮質醇異常分泌。這不僅會抑制褪黑激素的分泌，更會讓食慾素在深夜裡持續活化，強迫大腦維持在「高覺醒狀態（Hyperarousal）」。 這種令人崩潰的狀態就是，明明你已經累到不行，但大腦卻像停不下來的發電機！

長期的睡眠不足會導致體內促發炎細胞激素上升，而發炎反應又會進一步活化 HPA 軸，分泌更多皮質醇來試圖消炎，高濃度的皮質醇會進一步干擾深層睡眠與快速動眼期（REM），導致睡眠品質變得低弱又破碎，最終形成「壓力－發炎－失眠」的惡行循環。也就是說，你不是在跟睡眠上的意志力作對，而是在跟失控的生理長期鬥爭。

從腸道重啟好眠開關：PS150 菌株如何調校你的生理時鐘

面對這種煞車失靈的失眠困局，科學家們將目光投向了人體內另一個繁榮的生態系：腸道。腸道與大腦之間存在著一條雙向通訊的高速公路，這就是「菌-腸-腦軸 (Microbiome-Gut-Brain Axis, MGBA)」，而某些特殊菌株不僅能幫助消化、排便，更能透過神經與內分泌途徑與大腦對話，直接參與調節我們的壓力調節與睡眠節律。這種菌株被科學家稱為「精神益生菌」（Psychobiotics）。

在眾多研究菌株中，發酵乳桿菌 Limosilactobacillus fermentum PS150 的表現格外引人注目。PS150菌株源於亞洲益生菌權威「蔡英傑教授」團隊的專業研發，累積多年功能性菌株研發經驗的科學成果。針對臨床常見的「初夜效應」（First Night Effect, FNE），也就是現代人因出差、換床或環境改變導致的入睡困難，俗稱認床。科學家在進行實驗時發現，補充 PS150 菌株能顯著恢復非快速動眼期（NREM）的睡眠長度，且入睡更快，起床後也更容易清醒。更重要的是，不同於常見的藥物助眠手段（如抗組織胺藥物 DIPH）容易造成快速動眼期（REM）剝奪或導致睡眠破碎化，PS150 菌株展現出一種更為「溫和且自然」的調節力，它能有效縮短入睡所需的時間，並恢復睡眠中代表深層修復的「Delta 波」能量。

科學家發現，即便將 PS150 菌株經過特殊的熱處理（Heat-treated），轉化為不具活性但保有關鍵成分的「後生元」（Postbiotics），其生物活性依然能與活菌媲美 。HT-PS150 技術解決了益生菌在儲存與攝取過程中容易失去活性的痛點，讓這些腸道通訊員能更穩定地發揮作用 。

在臨床實驗中，科學家觀察到一個耐人尋味的現象：當詢問受試者的主觀感受時，往往會遇到強大的「安慰劑效應」，無論是服用 HT-PS150 還是安慰劑的人，主觀上大多表示睡眠變好了。這種「體感上的進步」有時會掩蓋真相，讓人分不清是心理作用還是真實效益。

然而，客觀的生理數據（Biomarkers）卻揭開了關鍵的差異。在排除主觀偏誤後，實驗數據顯示 HT-PS150 組有更高比例的人（84.6%）出現了夜間褪黑激素分泌增加，且壓力荷爾蒙（皮質醇）顯著下降，這證明了菌株確實啟動了體內的睡眠調控系統，而不僅僅是心理安慰。

最值得關注的是，對於那些失眠指數較高（ISI ≧ 8）的族群，這種「生理修復」與「主觀體感」終於達成了一致。這群人在補充 HT-PS150 後，不僅生理標記改善，連原本嚴重困擾的主觀睡眠效率、持續時間，以及焦慮感也出現了顯著的進步。

了解更多PS150助眠益生菌：https://lihi3.me/KQ4zi

重新定義深層睡眠：構建全方位的深夜修復計畫

睡眠從來就不只是單純的休息，而是一場生理功能的全面重整。想要重獲高品質的睡眠，關鍵在於為自己建立一個全方位的修復生態系。

這套系統的基石，始於良好的生活習慣。從減少睡前數位螢幕的干擾、優化室內環境，到作息調整。當我們透過規律作息來穩定神經系統，並輔以現代科學對於 PS150 菌株的調節力發現，身體便能更順暢地啟動睡眠開關，回歸自然的運作節律。

與其將失眠視為意志力的抗爭，不如將其看作是生理機能與腸道微生態的深度溝通。透過生活作息的調整與科學實證的支持，每個人都能擁有掌控睡眠的主動權。現在就從優化生活型態開始，為自己按下那個久違的、如嬰兒般香甜的關機鍵吧。

本文由 肺纖維化(菜瓜布肺)社團衛教 合作，泛科學撰文

在現代醫學的警示清單裡，乳癌、大腸癌這些疾病大家都不陌生；但有一個「隱蔽且致命」的威脅卻常被忽視，那就是「肺纖維化」。其中最常見的類型「特發性肺纖維化」（IPF），其預後往往不太樂觀，確診後的五年存活率甚至比許多常見的癌症還低。

首先，我們得先破解一個迷思：肺纖維化並不是單一疾病，而是許多種間質性肺病的共同表現。當我們聽到「肺纖維化」，腦中常浮現「菜瓜布肺」的形象，患者的肺部外觀充滿一個個空洞與疤痕，像極了乾燥的絲瓜。這精準描繪了肺部組織逐漸硬化、失去彈性的過程。

更重要的是，IPF 這類肺纖維化的威脅在於「不可逆」的特性，一旦形成就很難逆轉。這跟部分 COVID-19 康復者身上、仍有機會復原的肺纖維化，是兩種完全不同的概念。

肺部為何會變成「菜瓜布」？

為什麼好端端的肺會變成菜瓜布？這其實是一場身體修復機制失控的結果。

「纖維化」的組織，就是肺部間質組織（interstitium）的疤痕化。間質是圍繞在肺泡周圍，包含血管與支持肺部結構的結締組織。在正常情況下，肺部損傷後會啟動修復機制，並再生健康組織。但在肺纖維化的患者體內，這套修復機制卻「當機」了。

身體會不斷地發出訊號，導致負責修復工作的「纖維母細胞」（fibroblasts）被過度活化，進而失控地沉積膠原蛋白疤痕組織，最終在肺部形成永久性的纖維化。

科學家發現，這個過程之所以棘手，在於它是一個「惡性循環」，肺部同時存在著「發炎反應」與「纖維化」這兩條路徑 ，它們相互加乘，演變成難以阻斷的強大破壞力。

雖然特發性肺纖維化 (IPF) 的具體成因不明 ，但已知某些特定族群的風險更高。例如抽菸，特定年齡與性別(50歲以上男性)、長期暴露於粉塵環境的工作者(農業、畜牧業、採礦業…)、胃食道逆流者。此外，患有自體免疫疾病（如類風濕性關節炎、乾燥症、硬皮症、皮肌炎/多發性肌炎，）的患者，他們併發肺纖維化的機率遠高於一般人，必須特別警覺。

打斷惡性循環的挑戰，為何只對抗「纖維化」還不夠？

面對這個不可逆的疾病，醫學界長年束手無策，直到 2014 年才迎來一道曙光。美國 FDA 批准了兩種機制不同的新藥：Nintedanib 和 Pirfenidone。這兩種藥物的出現是治療史上的分水嶺，首度被證實能夠「延緩」IPF 患者肺功能的惡化速度。

然而，這場戰役尚未結束。現有的治療雖然帶來了希望，卻也凸顯了「未被滿足的醫療需求」。從機制上來看，這些藥物主要抑制的是「纖維化路徑」。

這讓科學界開始思考這個未被滿足的棘手問題：既然疾病的本質是「發炎」與「纖維化」的雙重打擊，那麼，我們是否能找到「同時抑制」這兩條路徑的全新策略，從而更有效地打斷這個惡性循環？

找到同時調控「發炎」與「纖維化」的新靶點

為了解決難題，科學家將目光鎖定在一個細胞內的酵素：磷酸二酯酶 4B（PDE4B）。

為什麼鎖定它？讓我們看看它的「雙重作用」機制：

1. 關鍵位置： PDE4B 同時存在於免疫細胞（與發炎有關）與纖維母細胞（與纖維化有關）當中。
2. 作用機制： PDE4B 的主要工作是降解細胞內一種叫 cAMP（環磷酸腺苷） 的訊號分子。cAMP 可以被視為細胞內的「穩定信號」。
3. 雙重抑制： 當我們使用藥物抑制了 PDE4B 的活性，細胞內的 cAMP 就不會被分解，濃度會隨之升高。高濃度的 cAMP 能穩定免疫細胞和纖維母細胞，同時產生抗發炎與抗纖維化的雙重效應。

簡單來說，鎖定並抑制 PDE4B，就像是同時抑制了免疫風暴與纖維化的工程，有望從雙從抑制打擊這個惡性循環。

全球臨床試驗帶來的新希望

近十年來，全球在肺纖維化領域投入了大量的臨床試驗，我們相信，在科學家逐步破解肺纖維化惡性循環的複雜難題後，期盼未來能為無數患者爭取到更安全、健康的生活與未來。

最後，我們必須再次提醒，特發性肺纖維化（IPF）與漸進性肺纖維化（PPF）是極具破壞性、且不可逆的疾病。面對這個比癌症更致命的對手，雖然現有的治療手段能延緩惡化，但無法逆轉已經形成的肺部疤痕組織，因此「早期診斷、早期治療」仍是對抗肺纖維化最重要的黃金時刻。

超高速光學顯微鏡，有影片有真相

動體視力對於運動員很重要，而研究移動快速的細胞、病毒、細菌時，為了讓顯微鏡底下的世界看得更快更清楚，中研院原子與分子科學研究所的謝佳龍助研究員，與團隊一起研發每秒可拍五十萬張影像的光學顯微技術，有助科學家在對生物系統造成最小干擾的情況下，直接觀察奈米尺度的活體現象。

超高速光學顯微鏡，追求速度與激清

2014 年諾貝爾化學獎，頒發給「超解析螢光顯微鏡」的發明團隊，當科學家得以在奈米尺度看見生命中最小「元件」運作時，例如細胞、病毒、細菌，就能發現傳統顯微技術無法察覺到的生物現象。看見各領域都想辦法為生物科學、醫學盡一份力，改善人類的健康，電機和光電工程背景的謝佳龍受到啟發。

我一直在尋找有什麼光學技術既簡單又可靠，而且影響力還能超越光學領域。

謝佳龍運用光學專業，改良廣泛使用的傳統明場（brightfield）顯微鏡，和團隊一起研發 COBRI 顯微鏡，可觀察奈米尺度單粒子在三度空間的高速運動。

COBRI 顯微鏡的核心概念是採用雷射作為光源，取代傳統的白熾燈，再透過干涉的方法，偵測線性散射（linear scattering）光訊號。當一個粒子的折射率和周圍環境不同時，在光的照射下便會將部分的光散射，運用這個特性就可以量測被觀察的粒子位於何處、又移到動哪裡。

追蹤拍攝單粒子時，「快狠準」是最重要的。謝佳龍團隊不斷改進顯微鏡的時間和空間解析度，一開始只想做到每秒拍幾千張影像，但慢慢地團隊越來越貪心，不斷試著超越極限。

目前實作中以一個 20 奈米直徑的金粒子為例，每秒可超高速拍攝五十萬張影像，並將金粒子的中心位置做到準確度 2 奈米的定位。

「要是我們可以做到……就好了」每次我向團隊說出更難的提議時，大家會崩潰吶喊「怎麼可能！」，但現在回頭看，過去不可能的事都是有可能的。

什麼東西跑得快？就決定觀察你了，病毒！

超高速光學顯微鏡，開啟許多過去無法進行的單分子生物研究。在中研院分子生物研究所的張雯博士的協助與建議下，謝佳龍團隊著手觀測牛痘病毒顆粒著陸在細胞表面上的高速運動。

生物學家們可以透過實驗了解病毒降落在細胞後會「發生什麼」，但無法直接看到「怎麼發生」，不知道病毒在過程中做了哪些奇怪的行為。

一開始，謝佳龍團隊在實驗室等了一整個下午，病毒都沒有掉到要觀測的細胞樣本上，比向月老求姻緣更難預測病毒降落細胞表面的時機。後來團隊成員黃逸帆想到一個方式突破困境，各位觀眾，請見下圖。

謝佳龍團隊透過超高速光學顯微鏡看見：當牛痘病毒粒子附著到細胞膜之後，一秒內便被侷限在幾百奈米的範圍中，並在微秒時間尺度下，做非常高速的橫向擴散運動（擴散係數〜1μm2/s）。影像紀錄的 3D 空間精準度 <3 nm，時間解析度高達每秒 100,000 幀。

我們看見病毒掉到細胞膜之後，在細胞膜上非常快速的擴散運動（diffusion），短暫地跟一些區域互動，最後找到一個區域停留，這是在我們觀察之前沒有人知道的。

觀測奈米尺度的活體現象，意義是？

以病毒為例，當病毒要入侵宿主細胞時，它如何遊走、它會不會進入細胞，跟病毒如何辨識細胞表面受體很有關連。雖然傳統分子生物實驗方法可以間接推測其關連性，但超高速光學顯微鏡能為整個過程提供第一手直接證據，有畫面有真相。

另外，超高速光學顯微鏡是在對生物系統造成最小干擾的情況下，直接觀察奈米尺度的活體現象，也能協助科學家檢驗傳統螢光標記的觀測方式，有沒有影響活體樣本原本的行為。

每個人都會有夢想，而對於打造出超高速光學顯微鏡的男人而言，謝佳龍希望能應用清楚看見奈米粒子高速運動的特性，協助找出健康問題的解決方案，例如細菌感染、腸病毒、登革熱病毒、或神經細胞的特定狀況。

儘管距離實現夢想還有一段路要走，但是謝佳龍想了想，很有自信地說：

只要朝對的方向走，再慢也會到達目的地。

延伸閱讀

• 謝佳龍的個人網頁
• 奈米生物光學實驗室
• Huang YF, Zhuo GY, Chou CY, Lin CH, Chang W, Hsieh CL*, “Coherent brightfield microscopy provides the spatiotemporal resolution to study early stage viral infection in live cells,” ACS Nano, 11(3), 2575 (2017).
• 〈在顯微鏡下拍一場高速電影：透過慢動作重播窺探生物系統的奈米世界〉

執行編輯｜林婷嫻  美術編輯｜張語辰

本著作由研之有物製作，以創用CC 姓名標示–非商業性–禁止改作 4.0 國際 授權條款釋出。

本文轉載自中央研究院研之有物，泛科學為宣傳推廣執行單位

本文轉載自顯微觀點

鎖定薄層 TIRF 顯微鏡成單分子研究關鍵

單分子技術（single-molecule techniques）主要是觀察「個別」分子特性和反應過程；其中，全內角反射螢光顯微鏡（Total Internal Reflection Fluorescence, TIRF）是單分子研究的基礎關鍵技術。

生物研究中，螢光顯微鏡是常見的儀器，利用螢光標記特定的分子。當螢光分子被特定波長的入射光激發，從低能階躍遷至高能階後，掉回原本低階能狀態的過程，便會而釋放出光子，發光成像。

但傳統寬視野螢光顯微鏡會激發整個深度的螢光分子，因此也會同時激發目標區以外的分子而造成雜訊；TIRF 則是利用介質的差異，將照明限制在較淺的深度、約 200 奈米以內，便可有效減少背景訊號。

還記得之前文章曾提過，當光從一種介質傳遞到另一種介質，部分反射，部分因為波速變化而發生折射，例如從水到空氣。

折射角度遵守斯涅耳定律（Snell’s law）：n1 × sinθ1 = n2 × sinθ2

其中，若 n1 折射率較高（光密介質）、n2 折射率較低（光疏介質），光線從 n1 射向 n2。

當入射角 θ1 小於臨界角 θc 時，光線部分往 n2 介質以 θ2 角度折射，部分往 n1 介質以 θ1 角度反射；當入射角 θ1 大於臨界角 θc 時，則沒有折射光線，產生全反射現象。

雖然全反射時，光不會進入第二介質發生折射，但在介面處仍會產生漸逝波（evanescent wave）。漸逝波的頻率與入射光相同，且強度隨與介面的距離增加呈指數衰減，並垂直介面、沿著 z 方向最多達到奈米級的深度。

^{全反射時在介面處仍會產生漸逝波（左圖），TIRF 顯微鏡利用此作為螢光激發光源，將照明限制在較淺的深度（右圖左）。圖片來源：Olympus 官網}

而穿透深度（d） 取決於入射照明的波長（λ）、入射角（θ1）以及介質的折射率（n）。

d = λ/4π × (n1² sin²θ1 – n2²)^-1/2

TIRF 顯微鏡便是利用這樣的漸逝波作為激發光源，激發樣本介面的螢光分子，產生全反射螢光影像。

TIRF 顯微鏡依據光入射路徑，可分為稜鏡型（prism-based） 與物鏡型（objective-based） 兩類。

在稜鏡型 TIRF 中，在樣本另一側使用稜鏡產生全反射，以激發細胞培養基上的螢光生物樣本，不需要特殊物鏡。但稜鏡型 TIRF 為了要達到較高的解析度，接收螢光的物鏡工作距離較短，樣本和物鏡間的空間較小，限制了研究者進一步對樣本進行操作。

物鏡型 TIRF 則是將物鏡除了作為收集螢光信號的鏡頭外，同時也作為發生全反射的稜鏡。入射光從物鏡邊緣射向樣本，並使用高數值孔徑（NA 通常在 1.45 以上）的物鏡實現大於臨界角的入射角，以產生全反射。

樣本與蓋玻片介面處產生漸逝波，激發樣本表面區域的螢光物質，同時以高數值孔徑的同一物鏡收集螢光顯微鏡影像。

理論上，一般光源也可作為全反射螢光顯微鏡的光源，但前面提到穿透深度與波長、入射角及折射率等都有關係，因此常以雷射作為光源。例如中研院單分子生物核心實驗室就以三個常用波長（485、532、640 nm）的雷射作為光源，並自動調節入射光源角度及漸逝波穿透深度。

由於 TIRF 顯微鏡的可觀察深度僅在 200 奈米以內，因此常結合螢光共振能量轉換法（fluorescence resonance energy transfer, FRET）、光鉗（optical tweezer）等技術，大量地應用在蛋白質、細胞膜等研究。而相較於也能鎖定 z 軸光學切面、不會受到太多背景干擾的共軛焦顯微鏡，TIRF 也能以更快速度獲取細胞膜運送物質，如胞吞、胞吐等作用的影像。

中研院單分子生物核心實驗室負責人黃婉媜便曾提到，由於 TIRF 顯微鏡的可觀察深度僅在 200 奈米以內，恰好細胞膜上非常多離子通道和受體以及訊息傳遞分子都位於此深度內，是研究藥物作用及藥物動力學很好的工具。

參考資料

1. 胡書銘（2008）。全反射螢光顯微術於生物單分子研究的樣品簡易處理。科儀新知，(164)，82-88。
2. 楊德明、林夏玉、蔡定平（2003）。全反射原理及在生物螢光顯微鏡之應用。科儀新知，(133)，67-73。
3. Olympus: Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy
4. MICROSCOPY U:Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

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