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能持續進行醫療監測的奈米管

peregrine
・2011/02/22 ・1632字 ・閱讀時間約 3 分鐘 ・SR值 558 ・八年級

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美國麻省理工學院(MIT)及麻薩諸塞州波士頓市東北大學(Northeastern University)的研究人員們,業已想出一種監測生物醫學指標,諸如血液中鈉或血糖等含量的新方法。此方法有朝一日可能引領出,譬如能讓糖尿病患者僅藉由看一眼小塊皮膚,來察看其血糖的植入式裝置。

為了監測生物醫學狀況或選擇性將藥物遞送到人體固定的器官或區域,諸多研究人員曾研發出充滿特定化學物質,以微粒子為基礎的裝置。不過,此些裝置的一項缺點是,此些粒子小到會隨著時間推移,而從最初的位置被清走。上述新方法涉及了能避開此問題的不同類微粒子。

儘管傳統的粒子是球形,不過此些粒子狀若管子。此些管子狹窄的寬度,使管子的內含物保持於非常接近血液或身體組織的狀態,而使得此些粒子易於感知周遭環境中的化學物質或其他狀態並作出反應。相對上,長度使得此些管子極適合被固定在需要長時間監測,或許持續進行達數個月的地方。

奈米等級的管子可以監測體內血糖或納含量,並且透過皮膚發光,圖片取自原文網址

最終,此些粒子可能被用來監測糖尿病患者的血糖含量,或一種會導致血液中鈉濃度劇變之疾病患者體內的鈉含量。

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該研究論文發表於《美國國家科學院院刊》(the Proceedings of the National Academy of Sciences)。合撰人包括麻省理工學院化學工程學教授Karen Gleason、東北大學藥劑學教授Heather Clark、麻省理工學院博士後研究員Gozde Ozaydin-Ince及東北大學博士生J. Matthew Dubach。

產生這些奈米粒子的方法,是Gleason研究藉由氣化及令塗料沉積於將被塗層的表面來塗層材料的方法之額外產物。在上個月發表的一項研究中,Gleason及其共同研究員們已經證實,這種稱為化學氣相沉積(chemical vapor deposition:CVD)的技術能被用來塗層含有微細孔洞的材料,從而賦予了即使更小的孔洞也能對所通過之物質化學屬性作出反應的表面。

該項使用化學氣相沉積技術來塗層已蝕刻出細小孔洞之氧化鋁的新研究,結果如同先前的研究,覆蓋層向下延展進入這些孔洞的內壁。之後,經過塗層的材料本體被溶解掉,而僅留下孔洞造成的一連串中空管子。不過在此之前,會添加另一種會對環境或對被遞送藥物作出反應的材料。之後,密封這些管子的任一端。

Gleason表示,此些管子可被注入皮下,以形成發螢光的號燈。她宣稱:「藉由發出螢光的物質來填充此些細小中空的管子,當管子在對存在的特定化學物質發生反應時,就能夠透過皮膚立即監測螢光的度數,如此便能持續對身體內特定化學物質的進行生理監測。由螢光化學物質發出的光是人類眼睛看得見的,因此無需另外的顯示器,而能直接由病人進行判讀。」

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Gleason表示,儘管最初是製造來察覺鈉含量,且於老鼠中測試成功。不過這些管子尚有各種潛在的應用。一種意義重大的可能應用是測定血糖含量:她宣稱:「嚴格控制血糖能有助於病患防止,糖尿病導致腎衰竭、失明、神經系統損傷及截肢,同時也是心臟衰竭、中風及先天缺陷等主要風險因子的毀滅性副作用。」當前,於美國糖尿病影響超過2千萬人,而預估於25年內會倍增。

開發出這種新技術的Gleason博士

Gleason表示,此些管子很細小(直徑約200奈米,也就是不及人類頭髮的1/100),以至於身體不覺得它們的存在,這使它們得以在不觸發任何身體反應的隱形模式下運作。

美國密西根大學化學、物理暨應用物理學教授及生物醫學工程學教授Raoul Kopelman宣稱:「基本上,這可以開啟避免需要化驗室、護士、額外時間及成本之血液檢驗的方法,就不易進行靜脈抽血的患者而言,也能避免諸多併發症。不過,安全因素是最大的絆腳石。美國食品暨藥物管理局(FDA)不僅擔心長期的化學毒性及生物排除(bio-elimination),而且擔心併發症,譬如,會否引發血液凝塊?」

此些管子除了被注入體內能停留於指定的位置之外,其製造方法本身也提供了顯著有利的因素。因為化學氣相沉積是半導體工業使用的標準製造方法,此些裝置的製造應相對容易且低廉。

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Gleason表示,人們可以想像使用此類管子來收縮包裝幾乎任何物質,包括能透過此些管子上的小孔洞,而隨時間推移被遞送的藥物。

原文網址:http://web.mit.edu/newsoffice/2011/update-microworms-0217.html

本文轉載自PEREGRINE科學點滴

翻譯:peregrine

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校對:Portnoy

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解密離岸風電政策環評:從審查標準到執行成效,一次看懂
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・2024/12/21 ・3546字 ・閱讀時間約 7 分鐘

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本文由 環境部 委託,泛科學企劃執行。 

政策環評是什麼,跟一般環評差在哪?

隨著公共建設的規模越來越大,傳統的環境影響評估(EIA),難以應對當今層層疊疊的環境議題。當我們評估一項重大政策時,只看「單一開發案」已經不夠,就像評估一棵樹,卻忽略了整片森林。因此,政策環境影響評估(SEA)應運而生,它看樹,也看森林,從政策的角度進行更全面的考量與評估。

與只專注於「單一開發案」的個案環評不同,政策環評更像是一場全面性的檢視,強調兩個核心重點:「整合評估」與「儘早評估」。簡單來說,這不再是逐案評估的模式,而是要求政府在制定政策時,就先全面分析可能帶來的影響,從單一行為的侷限中跳脫,轉而聚焦在整體影響的視角。無論是環境的整體變化,還是多項行為累計起來的長期影響,政策環評的目的就是讓這些潛在問題能儘早浮現、儘早解決。

除此之外,政策環評還像是一個大型的協商平台,以永續發展為最高指導原則,公開整合來自不同利益團體、民眾與各機關的意見。這裡,決策單位不再只是單純的「評分者」,而是轉為「協調者」或「仲裁者」,協調各方的意見看法在這裡得到整合,讓過程更具包容性。

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政策環評並沒有所謂的「否決權」,而是側重意見的蒐集與整合,讓行政機關在政策推動時,能更全面地掌握各方意見。政策環評旨在建立系統化、彈性的決策評估程序(包含量化、特徵化等評估方式),也廣納社會面或民眾滿意度等影響因子,把正式與非正式的作法一併考量進去。再來,決策程序中能層層檢討、隨時修正,也建立了追蹤機制和成效評估標準(如環境殘餘效應、累積效應等),透過學習來強化決策品質與嚴謹度。就像一場球賽,隨時根據變化、調整策略。

這樣的制度設計,就非常適合離岸風電這類規模大、跨區域、影響層面廣泛的能源政策評估,讓我們可以在政策推動初期就想到整個工程對環境、產業發展與社會的諸多影響,也為後續政策執行奠定更穩固的基礎。

政策環評並沒有否決權,而是重在整合各方意見、量化影響以及建立追蹤與修正機制,這樣的制度設計便適用於離岸風電等大型政策評估。圖/envato

離岸風電為何需要的是政策環評?

離岸風電是能源轉型的重要策略之一,但這不是只在某塊空地上架幾個風車,而是要在廣闊的大海中進行大規模建設,牽涉的不僅是發電,還涉及海洋保育、航空交通、水下文化資產等議題,更與當地漁民的權益息息相關。

這樣的大型離岸風電工程,因海洋環境的風險和不確定性極高,很容易讓人擔心生態影響。如何在海洋生態保護和綠能發展之間找到平衡點?這就需要政策環評的把關,從多方檢視這些複雜的挑戰,確保政策推行既能穩妥,又能達成發電目標。

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2016 年 3 月,經濟部自願提出「離岸風電區塊開發政策評估說明書」,是臺灣首次針對再生能源政策所進行的政策環評。根據這份評估說明書,政府將採分期公告、逐年檢討的方式,每三年開放 0.5~1 百萬瓩(GW)的電量額度鼓勵業者投入開發。當時環保署(現為環境部)歷經九個月召開 2 次意見徵詢會議,蒐集環評委員、專家學者、相關機關、民眾等意見,最終於同年 12 月的環評委員會作出徵詢意見。這些協商和檢討的過程,讓政策「名正言順」,得以充分顧及各方利益與生態平衡。

共通性環境議題與因應對策

在「離岸風電區塊開發政策評估說明書」中,環評會議盤點了開發過程中共通的環境議題。

首先,對於海洋生態保育的重點,特別是對中華白海豚的保護。環評會要求風機基座必須距離白海豚棲地1公里以上,以減少對其生態的干擾。實際上,這項規範在後續的實務執行中更為嚴格,例如,福海二期示範風場已退縮到 2.5 公里外,臺電二期風場甚至退到 4.2 公里外,顯示政策環評確實發揮了實質作用。此外,針對施工期間的聲音干擾,要求施工需有 30 分鐘以上的打樁緩啟動時間,並限制聲量不得超過 180 分貝等。

針對鳥類保育,政策環評也訂立了具體規範。其中,包括風機之間必須留設 500 公尺以上的鳥類穿行廊道,並在施工期間避開每年 11 月至隔年 3 月的候鳥過境期。同時,為確保這些措施確實生效,工程方也被要求設置「鳥類活動監測系統」,持續追蹤、評估風場對鳥類的影響。

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此外,環評會也確立了「先遠後近」的開發原則,要求優先開發較單純的航道外側區塊,待累積足夠經驗及相關資料後,再進行近岸區域的開發。這項原則考量了近海生態系的複雜性,也顧到養殖漁業的漁民權益,展現出政策環評在平衡發展需求與環境保護上的價值。

新一代的審查機制:達成能源轉型及環境保護雙贏

為提升環評效率並確保審查品質,環境部參考過去離岸風電審查經驗,制定「風力發電離岸系統開發行為環境影響評估初審作業要點」,建立了全新的二階段審查機制。

環境部推動二階段審查機制,提升離岸風電環評效率與審查品質。圖/envato

這套新機制分為兩個階段。第一階段,就像「初步檢查」,由環境部依照檢核表進行初審,並由環評審查委員會執行秘書邀集 2-5 位環評委員進行初審,通過第一階段初審之業者,可取得經濟部遴選資格,其初審結果有效期為兩年,必要時可申請展延一年。接著進入「第二階段」,開發單位檢附目的事業主管機關核配的容量證明文件等資料,提供更詳細的環境影響說明書以進行實質審查。

檢核表明確規範了 15 大項審查事項、112 項檢核項目,涵蓋開發案的全生命週期。

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工程面,包含風機及海上變電站基礎設置、海域電纜路線規劃、陸域設施工程等硬體設施的規範。其中,風機基礎設置必須避開海岸保護區、河口、潮間帶等環境敏感區域,且須進行地震危害度分析。海域電纜部分,除特殊情形外,埋設深度至少須達 1.5 公尺,且不得跨越中華電信海底電纜 1 公里的範圍。

環境保護上,檢核表則對施工噪音管制訂立了明確標準。舉例來說,打樁期間警戒區 750 公尺範圍內的水下噪音不得超過 160 分貝,且必須全程採用最佳噪音防制工法。同時,每個開發案或聯席審查的風場,同一時間內只能進行一支基樁施作,而日落前一小時到日出前也不得啟動新的打樁作業。

環境監測計畫更是檢核表中的重點,分為「施工前、施工期間、營運期間」三階段,每個階段都規定了詳細的監測要求(包括海域底質監測、水下噪音監測、鯨豚目視監測等)。以鯨豚監測為例,每年需執行20趟次,四季中每季至少執行 2 趟次。此外,所有監測數據都必須上傳至環境部「環保專案成果倉儲系統」(https://epaw.moenv.gov.tw/)供各界查閱。

這套標準化的審查機制不僅解決了「同一風場可能有多家廠商重複調查或審查」的資源浪費,也透過明確的檢核項目,讓開發單位在規劃階段就能掌握更具體的環境保護要求。不僅如此,該機制亦確保了環境保護標準前後一致,避免不同案件之間標準不一。

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結語

透過新的審查機制,環境部正積極推動再生能源開發案的環評審查作業,在提升行政效率之餘,也確保環境影響評估的品質,支持臺灣的離岸風電開發及國家能源轉型政策,也做好把關。藉由標準化檢核表和二階段審查制度,期待能在推動能源轉型的同時落實環境保護。

為確保制度能持續精進,環境部每半年至一年會進行制度檢討,並持續公開所有環評書件於「環評書件查詢系統」(https://eiadoc.moenv.gov.tw/eiaweb/)。此外,環評會議召開前一週,也必須在指定網站公布開會訊息,讓民眾能申請列席旁聽或發表意見。透明化措施一方面展現了政府推動永續發展的決心,另一方面也確保全民能共同參與監督離岸風電的發展過程。未來,這套制度將在各界的檢視與建議中持續完善,為臺灣的永續發展貢獻心力,發揮環評作業的最大效益。

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上網也要有「技術」!從言論、隱私到國安,你我都該懂的界線
鳥苷三磷酸 (PanSci Promo)_96
・2024/12/18 ・2366字 ・閱讀時間約 4 分鐘

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本文由 國家通訊傳播委員會 委託,泛科學企劃執行。 

以為鍵盤俠天下無敵?小心一個不留神就觸法!人們常忽略「網路並非法外之地」這個重要事實。不只現實生活中的法律同樣適用於網路空間,隨著科技發展,更多應網路特性而生的法律規範也相繼出現。從基本的言論自由到隱私權保護,從智慧財產權到國家安全,法律體系正全面性地回應數位時代的種種挑戰。

在臺灣,網路上的言論自由權利源自《憲法》第 11 條的明確規定:「人民有言論、講學、著作及出版之自由。」釋字第 509 號則指出,「國家應給予最大限度之維護,俾其實現自我、溝通意見、追求真理及監督各種政治或社會活動之功能得以發揮。」網路快速傳播的特性放大了言論的影響力,而大法官的解釋將言論自由的邊際刻畫得更明確,這在數位時代裡顯得格外重要。

網路與社群媒體的快速傳播,放大了言論的影響力。圖/unsplash

網路上的性、暴力與未成年保護

顯然言論自由並非是毫無限制,2023 年 11 月的一起案件就展現其中一種界線的樣貌。當時,一名 36 歲男子將他和網友在網咖的性愛影片上傳至推特,還寫下「《網咖包廂實戰計 1》我跟某公司 OL 戰鬥」等文字。這段影片一經發布,當事女子立即採取法律行動。最終,法院依其以網際網路「供人觀覽猥褻影像」的罪名,判處該名男子拘役 30 日,得易科罰金。這個判決清楚說明了,即便在虛擬空間,散布猥褻影像仍須承擔實質的法律責任。

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特別是在保護未成年人方面,法律的規範更加嚴格。《刑法》第 235 條明文禁止散布、播送或販賣猥褻物品,無論形式是圖文、聲音還是影像。而《兒童及少年性剝削防制條例》第 36 條更進一步禁止任何形式的兒童色情製品被製造、散布和持有。2019年彰化縣曾層發生過這樣一起案件:一名陳姓中年男子將9歲女童帶往居所,不僅強迫她觀看色情影片,還對她進行猥褻行為,甚至將過程上傳至 Google 雲端。儘管他後來試圖以資助女童就學表達悔意,法院仍以加重強制猥褻等罪,判處他 4 年 4 個月有期徒刑。

不實言論的散布同樣可能觸犯法律。2021 年 9 月爆發的「台大狼師案」就是一個警示。一名女大生在網路上指控教師誘騙她發生關係並傳染性病,幾個月後又指控對方對她進行強制性行為。當她提出告訴時,檢方卻查無性侵事實,加上她反覆的說詞,不僅性侵告訴失敗,還因誹謗罪反被加重判刑。

當駭客、間諜都轉戰網路戰場

2013 年,一名退役空軍上校赴陸經商時被情治單位吸收,返台後透過人脈網絡發展組織、刺探軍事機密,並以空殼公司掩護非法報酬,這個情報網持續運作了 8 年之久。

在涉及國家安全的議題上,法律的態度更是嚴厲。根據《國家安全法》第 2 條的規定,任何人都不得為境外敵對勢力及其控制的組織、機構進行資助、主持、操縱、指揮或發展組織,更不能洩漏、交付或傳遞公務機密,違反者將面臨嚴厲的刑事處罰。《刑法》規定,意圖破壞國體、竊據國土,或以非法方法變更國憲、顛覆政府者,處7年以上有期徒刑,首謀更要判處無期徒刑。

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抄襲與轉貼的邊界在哪裡?

在智慧財產權的保護上,臺灣也經歷了數位時代的轉變。台灣第一個網路著作權相關判決,就發生在傳統出版與數位平台的碰撞之中。南方社區文化網路負責人陳豐偉等三人在中山大學 BBS 上發表的文章,未經同意就被《光碟月刊》收錄在隨刊光碟中發行。三人向台北地檢署提告後,《光碟月刊》發行人兼總經理黃俊義被判處七個月有期徒刑,緩刑三年。這個判決為數位時代的著作權保護樹立了重要典範。

臺灣首例網路著作權案判決,為數位時代智慧財產權保護樹立典範。圖/envato

近年來,影音平台的著作權爭議更趨複雜。2022 年,知名 YouTube 頻道「觸電網」就因為片商車庫娛樂檢舉七十多支未經授權的影片,導致經營 12 年的頻道被迫下架。車庫娛樂透過律師聲明,這是針對「未經合法授權影音內容」的標準處理,並表明將追究民事與刑事責任。

受害了怎麼辦?申訴管道報你知

當我們在網路上的權利受到侵害時,可以根據侵害類型尋求不同的救濟管道。最基本的言論自由權利受到侵犯時,可以先向社群平台提出檢舉。若遇到更嚴重的情況,如散布猥褻影像、非法性私密影片等,除了平台檢舉外,還可以向警方提告,或是尋求衛福部「性影像處理中心」的協助。

在面對網路霸凌、不實言論時,可以向台灣事實查核中心、MyGoPen 等組織求助,協助澄清真相。若發現有害兒少身心健康的不當內容,則可以向 iWIN 網路內容防護機構提出申訴。這個由國家通訊傳播委員會支持的組織,會在受理後進行查核、轉介業者改善或依法處理。

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智慧財產權的侵害在網路時代極為常見,就像「觸電網」遭片商檢舉下架的案例。這類情況可以透過平台既有的著作權保護機制處理,情節嚴重者也可以提起民事訴訟要求賠償。若發現可疑的廣告或不公平交易行為,則可以向公平交易委員會檢舉;若是特定領域的違規內容,則應該向各該主管機關反映,例如藥品廣告歸衛福部管轄、證券期貨廣告則由金管會負責。

網路時代的法律規範正不斷演進,從個人隱私到國家安全,從言論自由到智慧財產權,每個面向都在尋求數位環境下的最佳平衡點。作為網路使用者,我們必須理解並遵守這些法律界線,同時也要懂得運用各種救濟管道保護自身權益。唯有每個人都清楚了解並遵守這些規範,才能共同營造一個更安全、更有序的網路環境。

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DNA-PAINT:轉瞬標記 奈米解析
顯微觀點_96
・2024/10/03 ・3586字 ・閱讀時間約 7 分鐘

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本文轉載自顯微觀點

圖/顯微觀點

DNA-PAINT:易脫落的奈米「漆」

DNA-PAINT 屬於單分子定位顯微術(SMLM)大家族一員,它突破繞射極限的途徑類似 PALM 與 STORM:以閃爍(blinking)的螢光讓多個目標分子的位置輪番呈現,最後將多次定位影像以電腦疊合重建成完整的超解析分子地圖。結合電腦運算輔助和光學成像的統計原理,DNA-PAINT 可以達成極端細緻的 RESI 定位術,清楚區別兩個距離不到 1 奈米的螢光來源。

單看字面,DNA-PAINT 給人「以 DNA 作為油漆」的印象。事實稍有不同,這種技術以 DNA 作為「點累積奈米成像術」(PAINT , Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography)的探針。接上螢光染劑的短小 DNA 片段,可以靈敏標記蛋白質、染色體以及許多細胞內構造。

DNA-PAINT 的特別之處,在於利用「不牢固」的螢光標記製造閃爍效果。不同於 PALM, STORM 以光調控「固著在目標上」的螢光來源,DNA-PAINT 使用與目標連結力量薄弱的螢光探針,結合目標之後會快速分離。只有在探針與目標結合的瞬間,同時被激發光照射,探針上的螢光團才能發出螢光。目標分子與螢光探針分離後,依然保有和下一個探針結合的能力,因此不必擔心螢光團的放光能力衰退。

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Dna Barcoded Labeling Probes For Highly Multiplexed Exchange Paint Imaging
DNA-PAINT 原理:Docking strand(嵌合序列)附著在人造 DNA 構造上,溶液中漂浮著成像序列(Imager strand),成像序列上的螢光團不容易被激發(膚色)。成像序列與嵌合序列結合時,螢光團才會被激發(橘紅色) 圖片來源:Agasti, Sarit S., et al. Chemical science 8.4 (2017): 3080-3091.

DNA-PAINT 使用的 DNA 探針片段長度不超過 10 個鹼基,又稱寡核苷酸(oligonucleotides 或oligomers)。這些短小 DNA 片段可以附加上螢光染劑的螢光團分子,成為螢光探針。

DNA 探針的結合對象是另一段互補的 DNA 片段,此互補序列會預先透過抗體與定位目標連結,等待 DNA 探針前來結合。DNA 探針因為具有螢光團,被稱為「成像片段(imager strand)」,而牢固於目標的互補序列則稱為「嵌合片段(docking strand)」。對生物細胞進行 DNA-PAINT 時,嵌合片段與目標分子之間常有抗體或配體做為銜接,需要類似免疫螢光染色的前置作業,目標表面的抗原也可以因應實驗需求進行設計。

因為兩個短小 DNA 片段之間的結合力有限,成像片段與嵌合片段結合後會快速分離。而螢光團只有在結合目標時才容易放光,因此可以形成閃爍的螢光定位標記。經由電腦疊合閃爍的定位影像,DNA-PAINT 可以達成 10 奈米左右的超解析定位,若沒有序列成像的幫助,依然無法突破奈米以下解析度的光學障礙。

Direct Visualization Of Single Nuclear Pore Complex Proteins Using Genetically‐encoded Probes For Dna‐paint
以 DNA-PAINT 對細胞核膜上的 Nup96 核孔蛋白進行 3D 定位。在圖 a. 中,不同的螢光色彩象徵不同的空間深度。圖 b. 箭頭所指處,則是成對出現的 Nup96 蛋白。比例尺:圖 a. 2000nm, 圖 b. 50 nm. 圖片來源:Schlichthaerle, Thomas, et al. Angewandte Chemie 131.37 (2019): 13138-13142.

核孔複合體(Nuclear Pore Complex)上的 Nup96 蛋白是科學家經常探索的重要目標,即使是超解析顯微術也未能在自然狀態下呈現其構造。隆曼團隊以 RESI 對 Nup96 進行定位,不但清楚定位出符合電子顯微鏡拍攝的 8 對 Nup96 蛋白沿著核孔形成環狀結構,還能清楚呈現每對蛋白之間的 11 奈米的間距。

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結合序列成像(Sequential Imaging)與 DNA-PAINT 兩種技術,RESI 讓科學家得以運用一般門檻的顯微儀器、耗材,就能達到超乎以往想像的定位解析度。而 DNA-PAINT 這種巧妙的定位方法並非一蹴而就,而是數種有趣的技術累積而成。

PAINT 起源:不穩定又不專一的尼羅紅

PAINT(Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography, 點累積奈米成像術)系列定位法的螢光探針由一個螢光染劑分子與一個分子探針(probe)構成。親和性抗體、寡核苷酸(短小 DNA 片段)都可作為分子探針的材料,再由此探針結合目標分子或其上的抗體。除了 DNA-PAINT, PAINT 家譜上還有 FRET-PAINT, Exchange-PAINT, u-PAINT 等不同特質的成員。

在 2006 年由沙羅諾夫(A. Sharonov)和霍克崔瑟(R. M. Hochstraser)發表的第一代 PAINT 中,僅僅使用螢光染料尼羅紅(Nile Red)為標記。這種染劑在含水溶劑中無法發光,必須進入磷脂層等非極性環境才能展現其螢光活性。

因此尼羅紅無須結合探針,只要以低濃度加入樣本溶液中,就能觀察到其進入細胞膜脂雙層、大型磷脂囊泡(large unilamella vesicles)表層等疏水性環境中,受到激發放出螢光。尼羅紅與磷脂層的親和性不強,很快就會再次脫離,也容易遭到光漂白(photobleaching)而失去螢光,因此可作為一種閃爍的螢光定位標記。

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尼羅紅可以結合所有疏水性(hydrophobic)的構造,無法真的標記特定分子,缺乏分子生物學重視的專一性。但它開啟了 PAINT 以「不牢固螢光染劑」增進解析度的先河。與多數螢光顯微術追求螢光團穩定性與強度的定位技巧背道而馳。

Image 2
圖 a. 以尼羅紅標記磷脂層的直接成像;圖 b. 以 PAINT 技術進行上千次成像重建後的磷脂層定位。兩者定位解析度形成強烈對比。圖 c. 為 uPAINT 概念:接受激發光(綠色)照耀的螢光探針才會發光(紅色),漂浮在激發光範圍外的螢光探針保持黯淡(粉紅),即使未結合目標的探針也能發光,且僅能標記細胞膜表面的目標。圖片來源:Nieves, Daniel J., et al. Genes 9.12 (2018): 621.

4 年後,吉安諾內(G. Giannone)和荷西(E. Hosy)以具目標專一性的配體,例如抗體蛋白,連接螢光團形成螢光探針,達成具有專一性的 PAINT 超解析定位。透過進步的生化技術製作配體,這種技術幾乎可以定位所有類型的目標,因此被命名 universal-PAINT, 簡稱 uPAINT。

uPAINT 可以提升多種目標的定位解析度,但其螢光探針即使游離在溶液中,也能接受激發、放出螢光,形成背景雜訊。且結合螢光染劑的抗體無法穿透細胞膜,因此只能定位細胞膜上的目標。

因此 uPAINT 必須限縮激發光照射的範圍,對準目標、減少雜訊,例如微調全內反射顯微鏡(TIRF)的角度,形成「高傾斜層光照明」(Highly Inclined and Laminated Optical sheet, HILO)以限定激發範圍。

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同在 2010 年,隆曼與史坦豪爾(C. Steinhauer)嘗試以寡核苷酸為探針,定位 DNA 摺紙構造(DNA origami structure)上的目標,達到了奈米等級的解析度。DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography 正式誕生,善用「不牢固的螢光探針」與電腦運算的輔助,以一般螢光顯微鏡就能突破繞射極限。

無限調色的虛擬油漆:Exchange-PAINT

2014 年,隆曼與同事阿凡達尼歐(M. S. Avendaño)、沃爾斯坦(J. B. Woehrstein)發表 DNA-PAINT 的巧妙變化,除了同時以不同探針標記不同構造,達成精準的多重定位(multiplexed localization),更實現以一種螢光超解析定位多種目標,讓多重標記的潛力加速實現。

這種多重標記被隆曼與同事稱為 Exchange-PAINT,同樣使用 DNA 片段作為探針。在同一個樣本的 10 種不同目標上,連結了 10 種不同的嵌合片段(docking strands),隆曼等人再以 10 種互不干涉的短小 DNA 序列(orthogonal sequences)作為成像片段(imager strands)。

他們每次只加入一種成像片段,針對一種目標進行閃爍(blinking)定位,並由電腦套上特定顏色,接著洗去既有成像片段,再加入下一種成像片段。最後將所有目標的獨立定位圖疊合起來,便能得到完整的奈米級定位。

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Multiplexed 3d Cellular Super Resolution Imaging With Dna Paint And Exchange Paint 2
圖 a.為 Exchange-PAINT 概念,每一輪定位針對一種目標,完成後洗去探針,再加入下一種探針進行定位,最後將每一輪的定位影像疊合起來。圖 c., 圖 d. 表現 Exchange-PAINT 的多工能力, 1 個 DNA 摺紙樣本上的 10 種不同目標可以依序定位,賦予顏色(實際上使用相同螢光染劑,不同成像片段),再以電腦重建疊合。每一種目標的定位都進行了 7500 次拍攝。圖 d., 圖 e. 中的比例尺為 25nm. 圖片來源:Jungmann, Ralf, et al.  Nature methods 11.3 (2014): 313-318.

只需要一種螢光染劑接上多種成像片段,Exchange-PAINT 便能以基本的實驗設備達到多重目標的超解析定位,不像多重標記的 DNA-PAINT 受限於染劑顏色數目,Exchange-PAINT 的門檻在於互不相干寡核甘酸片段的數目,在實驗中幾乎不可能窮盡。而可以使用一般螢光顯微鏡與螢光染劑達到埃(ångström)解析度的 RESI 技術,就是將 Exchange-PAINT 的多種目標定位應用於單種目標定位,透過不同探針標記同種目標製造發光順序落差,大幅提升解析度。

在「眼見為真」的生物學影像趨勢中,「增加偵測光子數量」是螢光顯微技術提升解析度的基礎光學原理,也是最主流的技術改良方向。而 DNA-PAINT 系列技術跳脫了對光子數量的追求,不受螢光染劑的光漂白及螢光壽命限制,以快速脫落的探針另闢蹊徑,使低成本的超解析影像得以實現,更展現生物物理學蘊藏的廣泛技術可能性。

參考資料:

  • DNA-PAINT 的最新應用:RESI序列成像解析度增強術
  • Jungmann, Ralf, et al.  Nature methods 11.3 (2014): 313-318.
  • Agasti, Sarit S., et al.  Chemical science 8.4 (2017): 3080-3091.
  • Nieves, Daniel J., Katharina Gaus, and Matthew AB Baker. Genes 9.12 (2018): 621.
  • Schlichthaerle, Thomas, et al.  Angewandte Chemie 131.37 (2019): 13138-13142.
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顯微觀點_96
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