本文轉載自顯微觀點
DNA-PAINT：易脫落的奈米「漆」
DNA-PAINT 屬於單分子定位顯微術（SMLM）大家族一員，它突破繞射極限的途徑類似 PALM 與 STORM：以閃爍（blinking）的螢光讓多個目標分子的位置輪番呈現，最後將多次定位影像以電腦疊合重建成完整的超解析分子地圖。結合電腦運算輔助和光學成像的統計原理，DNA-PAINT 可以達成極端細緻的 RESI 定位術，清楚區別兩個距離不到 1 奈米的螢光來源。
單看字面，DNA-PAINT 給人「以 DNA 作為油漆」的印象。事實稍有不同，這種技術以 DNA 作為「點累積奈米成像術」（PAINT , Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography）的探針。接上螢光染劑的短小 DNA 片段，可以靈敏標記蛋白質、染色體以及許多細胞內構造。
DNA-PAINT 的特別之處，在於利用「不牢固」的螢光標記製造閃爍效果。不同於 PALM, STORM 以光調控「固著在目標上」的螢光來源，DNA-PAINT 使用與目標連結力量薄弱的螢光探針，結合目標之後會快速分離。只有在探針與目標結合的瞬間，同時被激發光照射，探針上的螢光團才能發出螢光。目標分子與螢光探針分離後，依然保有和下一個探針結合的能力，因此不必擔心螢光團的放光能力衰退。
DNA-PAINT 使用的 DNA 探針片段長度不超過 10 個鹼基，又稱寡核苷酸（oligonucleotides 或oligomers）。這些短小 DNA 片段可以附加上螢光染劑的螢光團分子，成為螢光探針。
DNA 探針的結合對象是另一段互補的 DNA 片段，此互補序列會預先透過抗體與定位目標連結，等待 DNA 探針前來結合。DNA 探針因為具有螢光團，被稱為「成像片段（imager strand）」，而牢固於目標的互補序列則稱為「嵌合片段（docking strand）」。對生物細胞進行 DNA-PAINT 時，嵌合片段與目標分子之間常有抗體或配體做為銜接，需要類似免疫螢光染色的前置作業，目標表面的抗原也可以因應實驗需求進行設計。
因為兩個短小 DNA 片段之間的結合力有限，成像片段與嵌合片段結合後會快速分離。而螢光團只有在結合目標時才容易放光，因此可以形成閃爍的螢光定位標記。經由電腦疊合閃爍的定位影像，DNA-PAINT 可以達成 10 奈米左右的超解析定位，若沒有序列成像的幫助，依然無法突破奈米以下解析度的光學障礙。
核孔複合體（Nuclear Pore Complex）上的 Nup96 蛋白是科學家經常探索的重要目標，即使是超解析顯微術也未能在自然狀態下呈現其構造。隆曼團隊以 RESI 對 Nup96 進行定位，不但清楚定位出符合電子顯微鏡拍攝的 8 對 Nup96 蛋白沿著核孔形成環狀結構，還能清楚呈現每對蛋白之間的 11 奈米的間距。
結合序列成像（Sequential Imaging）與 DNA-PAINT 兩種技術，RESI 讓科學家得以運用一般門檻的顯微儀器、耗材，就能達到超乎以往想像的定位解析度。而 DNA-PAINT 這種巧妙的定位方法並非一蹴而就，而是數種有趣的技術累積而成。
PAINT 起源：不穩定又不專一的尼羅紅
PAINT（Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography, 點累積奈米成像術）系列定位法的螢光探針由一個螢光染劑分子與一個分子探針（probe）構成。親和性抗體、寡核苷酸（短小 DNA 片段）都可作為分子探針的材料，再由此探針結合目標分子或其上的抗體。除了 DNA-PAINT, PAINT 家譜上還有 FRET-PAINT, Exchange-PAINT, u-PAINT 等不同特質的成員。
在 2006 年由沙羅諾夫（A. Sharonov）和霍克崔瑟（R. M. Hochstraser）發表的第一代 PAINT 中，僅僅使用螢光染料尼羅紅（Nile Red）為標記。這種染劑在含水溶劑中無法發光，必須進入磷脂層等非極性環境才能展現其螢光活性。
因此尼羅紅無須結合探針，只要以低濃度加入樣本溶液中，就能觀察到其進入細胞膜脂雙層、大型磷脂囊泡（large unilamella vesicles）表層等疏水性環境中，受到激發放出螢光。尼羅紅與磷脂層的親和性不強，很快就會再次脫離，也容易遭到光漂白（photobleaching）而失去螢光，因此可作為一種閃爍的螢光定位標記。
尼羅紅可以結合所有疏水性（hydrophobic）的構造，無法真的標記特定分子，缺乏分子生物學重視的專一性。但它開啟了 PAINT 以「不牢固螢光染劑」增進解析度的先河。與多數螢光顯微術追求螢光團穩定性與強度的定位技巧背道而馳。
4 年後，吉安諾內（G. Giannone）和荷西（E. Hosy）以具目標專一性的配體，例如抗體蛋白，連接螢光團形成螢光探針，達成具有專一性的 PAINT 超解析定位。透過進步的生化技術製作配體，這種技術幾乎可以定位所有類型的目標，因此被命名 universal-PAINT, 簡稱 uPAINT。
uPAINT 可以提升多種目標的定位解析度，但其螢光探針即使游離在溶液中，也能接受激發、放出螢光，形成背景雜訊。且結合螢光染劑的抗體無法穿透細胞膜，因此只能定位細胞膜上的目標。
因此 uPAINT 必須限縮激發光照射的範圍，對準目標、減少雜訊，例如微調全內反射顯微鏡（TIRF）的角度，形成「高傾斜層光照明」（Highly Inclined and Laminated Optical sheet, HILO）以限定激發範圍。
同在 2010 年，隆曼與史坦豪爾（C. Steinhauer）嘗試以寡核苷酸為探針，定位 DNA 摺紙構造（DNA origami structure）上的目標，達到了奈米等級的解析度。DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography 正式誕生，善用「不牢固的螢光探針」與電腦運算的輔助，以一般螢光顯微鏡就能突破繞射極限。
無限調色的虛擬油漆：Exchange-PAINT
2014 年，隆曼與同事阿凡達尼歐（M. S. Avendaño）、沃爾斯坦（J. B. Woehrstein）發表 DNA-PAINT 的巧妙變化，除了同時以不同探針標記不同構造，達成精準的多重定位（multiplexed localization），更實現以一種螢光超解析定位多種目標，讓多重標記的潛力加速實現。
這種多重標記被隆曼與同事稱為 Exchange-PAINT，同樣使用 DNA 片段作為探針。在同一個樣本的 10 種不同目標上，連結了 10 種不同的嵌合片段（docking strands），隆曼等人再以 10 種互不干涉的短小 DNA 序列（orthogonal sequences）作為成像片段（imager strands）。
他們每次只加入一種成像片段，針對一種目標進行閃爍（blinking）定位，並由電腦套上特定顏色，接著洗去既有成像片段，再加入下一種成像片段。最後將所有目標的獨立定位圖疊合起來，便能得到完整的奈米級定位。
只需要一種螢光染劑接上多種成像片段，Exchange-PAINT 便能以基本的實驗設備達到多重目標的超解析定位，不像多重標記的 DNA-PAINT 受限於染劑顏色數目，Exchange-PAINT 的門檻在於互不相干寡核甘酸片段的數目，在實驗中幾乎不可能窮盡。而可以使用一般螢光顯微鏡與螢光染劑達到埃（ångström）解析度的 RESI 技術，就是將 Exchange-PAINT 的多種目標定位應用於單種目標定位，透過不同探針標記同種目標製造發光順序落差，大幅提升解析度。
在「眼見為真」的生物學影像趨勢中，「增加偵測光子數量」是螢光顯微技術提升解析度的基礎光學原理，也是最主流的技術改良方向。而 DNA-PAINT 系列技術跳脫了對光子數量的追求，不受螢光染劑的光漂白及螢光壽命限制，以快速脫落的探針另闢蹊徑，使低成本的超解析影像得以實現，更展現生物物理學蘊藏的廣泛技術可能性。
參考資料：
- DNA-PAINT 的最新應用：RESI序列成像解析度增強術
- Jungmann, Ralf, et al. Nature methods 11.3 (2014): 313-318.
- Agasti, Sarit S., et al. Chemical science 8.4 (2017): 3080-3091.
- Nieves, Daniel J., Katharina Gaus, and Matthew AB Baker. Genes 9.12 (2018): 621.
- Schlichthaerle, Thomas, et al. Angewandte Chemie 131.37 (2019): 13138-13142.
