什麼是「近場光學顯微術」？為何它是開啟奈米世界大門的關鍵？

本文轉載自顯微觀點

攝影之前的顯微傳播

在顯微鏡已是博物學家必備工具的 19 世紀中葉，銀版攝影技術才剛發明不久，結合兩者的顯微攝影（photomicrograph）隨之邁出第一步。但顯微攝影直到 19 世紀末才真正普及化、以客觀與速度成為自然科學研究的技術。

在此之前，由繪圖師在顯微鏡前臨摹描繪是顯微影像 200 年來的記錄與傳播方法，從休閒式的顯微圖鑑，到科學界的分類學文獻，都有賴精細可信的顯微繪圖。當時的分類學家或解剖學家經常培養出顯微繪圖能力，但與顯微繪圖師分工可以提升效率與美學。儘管有投影描繪器（camera lucida）可作為素描輔助，每個顯微繪圖師的筆觸還是會呈現鮮明的技巧與個人風格差異。

韋斯特（Tuffen West）是維多利亞時代最為人稱道的顯微繪圖師之一，職業生涯長達四十年，以精美版畫將成千上萬種生物型態傳達讀者眼前。他的顯微繪圖可見於醫學、動植物與微生物的科學著作與期刊，並在後世被評論為藝術品，盛年時往往受到最負盛名的博物學家與科普作家雇用。同時，他也是積極的博物學家和顯微技術推廣者。

失去聽力 放大視覺

1823 年，韋斯特出生於英格蘭約克郡。父親是個熱衷化學實驗的藥師，在不列顛科學促進會 ( British Association for Advancements of Science ) 位居要職。韋斯特從小就展現對自然與博物學的興趣，他一面按照父親的安排習醫，一面維持蒐集動植物標本的愛好，他 19 歲時發表的鳥類比較解剖學論文贏得了一筆可觀的獎金。

韋斯特 22 歲那年，他的醫學生涯戛然而止。他在父親的化學實驗室遭遇爆炸，幾乎完全失聰，失去行醫的基本能力。但他繼續使用顯微鏡觀察樣本，並開始練習版畫技術；在 25 歲時完成第一幅署名的版畫，並在 27 歲受女王學院雇用，為矽藻進行一系列顯微繪圖。

石版印刷：科普浪潮的技術基礎

韋斯特的弟弟威廉（William West）是在倫敦執業的版畫家及印刷匠，曾為達爾文繪製《物種起源》第一版的物種樹狀圖（也是該版唯一的圖片）。兄弟兩人經常合作為醫學著作繪畫製版，通常是韋斯特繪畫，威廉製版。儘管最後韋斯特的科學繪圖作品豐碩許多，但他最初的版畫技術很可能是由威廉傳授。

這對兄弟對版畫內容的志趣可能不同，但對美學有著共同的堅持。他們經常在作品下方註明，使用彩色平版印刷（Chromolithography）技術，而非新穎的技術競爭對手—石板淡彩畫（Lithotint）。

1796 年發明的石版印刷，在新世紀成為廣受歐洲各國歡迎的大量圖片複製技術，科學刊物中的印刷版畫，無不經過「繪圖、製版、印刷」三道工序。其中製版的工藝關乎圖畫如何呈現在出版物上，對美感與技術的需求不下於繪製原圖。

19 世紀早期流行的彩色平版印刷中，每一種顏色需要一塊獨立的石板，每一塊石板的圖案必須精準對齊，以繁複的工藝堆疊出豐富亮眼的色澤。而石板淡彩畫每一幅圖畫則只需一塊石板，效率高、成本低，但能表現的顏色有限。韋斯特兄弟堅持較費工夫，色彩美感更為豐厚的彩色平版印刷。

醫學與公衛潮流中嶄露頭角

韋斯特在解剖學繪圖成名的一系列作品也源自其家族成員，他的連襟、口腔醫學之父哈欽森（J. Hutchinson）。哈欽森出版的眾多創新醫學著作包含壁蝨、梅毒、豬囊蟲感染病徵的顯微圖像，都由韋斯特兄弟繪製。他們持續為哈欽森創立的新希德南協會（New Sydenham Society）出版物作畫，合作直到威廉過世。

透過著重翻譯歐陸醫學文獻的新希德南協會，韋斯特兄弟得以觀察、繪製當時嶄新的顯微解剖構造。例如，荷蘭精神疾病與癲癇研究奠基者：施洛德范德柯克（J. Schroeder van der Kolk）涵蓋脊髓到延腦的解剖學報告。韋斯特兄弟的工藝描繪出繁複寫實的神經細胞、腦葉解剖圖，將歐陸最新醫學知識帶到英國讀者眼前。

韋斯特的生涯起步階段深受 19 世紀英國的重大瘟疫與食安議題影響。他曾參與公衛先驅哈索爾（A. H. Hassall）的病源調查任務，在 1855 年倫敦霍亂疫情後，出版檢驗市內民生用水的《各處水質顯微檢驗》。

水質檢驗報告中生動的微生物繪圖，皆由繪圖師前輩米勒（H. Miller）作畫，韋斯特製版。透過精細均衡的版畫成品和大眾對水質的關注，韋斯特奠定了技術細膩的名聲。

後來，哈索爾以《刺胳針》期刊曝光當時常見的食品摻假惡行時，持續與小有名氣的韋斯特合作繪圖，以寫實顯微圖像向大眾呈現來自倫敦四處商販的食品樣本。

直到食品摻假報告集結成冊，哈索爾才在序言說明，他多年前的醫學成名作《人體的顯微解剖：疾病與健康》也包含許多韋斯特的畫作，那是韋斯特參與的第一個科學顯微繪圖作品，合作期間哈索爾還讓初出茅廬的韋斯特住在自己家裡，在充沛的支援下工作。可惜的是，哈索爾的主要著作中，多數顯微繪圖都沒有畫家署名，因此無法判斷哪些繪圖是由韋斯特繪圖或製版。

畫筆風靡大洋兩岸

醫學領域以外，韋斯特也用鮮明精密的畫風描繪博物學圖像。史密斯（W. Smith）所著《不列顛矽藻概要》裡面層次豐富、色彩飽滿的顯微繪圖，使韋斯特作品在博物學家、科普讀者間一時洛陽紙貴。

韋斯特因此受到海洋生物學先驅、水族館創始人葛斯（P. H. Gosse）邀請，合作出版科普讀物。身為博物學家的葛斯具備出眾的顯微繪畫技能，甚至比 19 世紀末聞名歐洲的博物學兼繪畫家海克爾（E. Haeckel）更具聲望。受到葛斯邀請繪圖，表示韋斯特已躋身當時最傑出的顯微繪圖師行列。

葛斯的著作《顯微鏡前的夜晚》 是當年大西洋兩岸最受歡迎的科普著作。書中以創造論解釋生物型態多樣性的宗教觀念、鮮明多樣的生物插圖廣受歐美讀者歡迎。韋斯特與著名的解剖學家兼科學畫家福特（G. H. Ford）合作為本書繪圖，但兩人都沒有署名，難以分辨書中精湛的繪圖分屬哪位作者。

韋斯特也曾為當時最熱門科普作家伍德（J. G. Wood）巨著《博物學》作畫。伍德的作品包含從藻類、草履蟲到寵物犬等生物萬象，他的文字和韋斯特的繪圖深刻影響讀者對生物多樣性與人類起源的想像。當時知名文學家如馬克．吐溫和柯南．道爾都曾在小說中引用伍德的科普內容。

離開顯微鏡，韋斯特的巨觀博物學繪圖依然出色，尤其是針對節肢動物。蛛形動物學開拓者，布萊克沃（J. Blackwall）的《不列顛與愛爾蘭蜘蛛史》、維多利亞時代罕見的女性昆蟲學家史戴維利（E.F. Staveley）的《不列顛蜘蛛》都由韋斯特繪製版畫。栩栩如生的細節、緊密的版面，彰顯了韋斯特博物學繪圖的特色。

韋斯特受雇進行顯微繪圖時，通常由博物學家郵寄為他特製的顯微玻片，讓他自行細細觀察、從容描繪。令人好奇的是，韋斯特的蜘蛛博物學版畫上，總是註明 ”sc. ad nat.” 表示他觀察自然樣本（after nature）進行描繪，而非臨摹他人作品。或許，這些蜘蛛也是由郵差送到韋斯特手上的。

圖文交織，拓展微觀

除了陸地生物，韋斯特為專書、期刊描繪的主題包括有孔蟲、單細胞動物、從海葵到鯨豚等海洋生物，栩栩如生的彩色圖畫拓展了大眾對博物學的興趣。

其中一群可能受彩色圖畫吸引而親近博物學的目標讀者，就是維多利亞時代的中上階層女性。她們雖曾受高等教育、具備社會地位與經濟資本，卻無法加入學會，也罕有機會研究自然、從事博物學相關職位。

例如，倫敦雅典娜俱樂部（The Athenaeum Club），這個以希臘女神為名、服從英國女王的組織，在19世紀初成立時，已經是科學、藝文、法政菁英紳士踴躍參與的知性俱樂部，卻直到2002年才開放女性成為會員。當年俱樂部中的動物學家如瓊斯（T. R. Jones）就強調利用「女性感興趣的」的自然題材、韋斯特栩栩如生的繪圖來吸引維多利亞時代女性讀者。

在林奈學會記錄中，韋斯特謙稱自己是顯微繪圖師，博物學只是業餘愛好。但是他在顯微技術推廣的成果，遠遠超出單純繪圖師的工作範疇。

韋斯特曾推出一系列的顯微知識專欄文章，分享自己的研究心得。1860年代在《休閒科學》（Recreative Science）上著重於他早期對矽藻的蒐集與觀察。1880至1890年代的〈顯微鏡前的一小時〉〈顯微鏡前的30分鐘〉（專欄命名顯然是模仿暢銷書《顯微鏡前的半小時》）則大幅擴展，包含微生物、種子、昆蟲器官的顯微素描以及顯微鏡操作技巧等。

經常以郵件接收顯微樣本的韋斯特在 1875 年成為「郵政顯微協會」（Postal Microscopical Society）主席。該組織建立各地顯微愛好者交流樣本與知識的平台，並在月刊上評析會員們郵寄分享的最新玻片。韋斯特對樣本的縝密觀察與評論，是當時會員們最為珍視的回饋。

全能的科學傳播者

推廣顯微知識的行動中，韋斯特不僅從事評析或繪圖。在他參與的兩本暢銷科普讀物《顯微鏡前的半小時》《顯微鏡下的常見物體》中，他負責篩選樣本、精工製圖，科普作家再以這些顯微繪圖為核心寫作。韋斯特的選樣和繪圖決定了整本書的走向。

《顯微鏡前的半小時》文字作者蘭卡斯特（E. Lankester）在第二版序文中，感謝韋斯特精采的顯微版畫，搭配「作者」的後續著述介紹，在市場上大受歡迎。蘭卡斯特認為韋斯特佔據首要功勞。

與科普作家伍德合著《顯微鏡下的常見物體》時，韋斯特不僅擔任挑選顯微樣本、繪製版畫（此步驟決定了後續文字的走向），也負責印刷的校樣，責任比文字作者更加吃重。此書獲得讀者們熱愛，持續再版直到20世紀。

主導了兩本堪稱史上最受歡迎的顯微科普書，韋斯特卻不曾以作者名義出版專書。他曾在科學期刊發表數篇博物學論文，涵蓋植物、昆蟲、矽藻的顯微構造，採樣與觀察、寫作與繪圖都由他一手包辦。

據佚名資料，蒼蠅足部型態的比較形態學研究是韋斯特最得意之作。韋斯特在 1860 年代發表的矽藻博物學與蒼蠅足部論文，在西元 2020 年後依然有科學家引用。

在《顯微鏡下的常見物體》的出版過程中位居要角的韋斯特，在初版書名頁與印刷者並列，重要性僅次於作者伍德。但隨著版本演進，在 1949 年的再版中，韋斯特的名字已完全消失了。

同樣熱銷的科普圖書《顯微鏡前的半小時》出版歷程中，韋斯特也遭逢一樣的命運。儘管文字作者蘭卡斯特曾表示韋斯特的貢獻最為重要，但是他的名字卻在 1876 年及其後的各版本付之闕如，此時韋斯特的顯微繪圖與科學寫作工作也幾乎停擺。

空白與堅持

韋斯特在 1864 年前後，以及整個 1870 年代都遭遇生產力低落的問題，問世的畫作與文章寥寥無幾。直到 1882 年後，韋斯特才穩定地為期刊作畫並刊載科普專欄，但再也沒有產出研究論文或專書版畫。

創作死寂的階段，正是韋斯特頻繁進出精神療養院的歲月。他的症狀缺少明確醫療記錄，但研究者認為，頻繁的住院符合躁鬱症的週期特徵。

1862 年起，壯年的韋斯特病況不斷起伏，不時住院。即使到他退休後，依然無法逃脫精神症狀的折磨，1879 到 1883 年間，花甲之年的韋斯特在精神療養院裡度過了 31 個月。從首次入院到 1891 年過世，他在療養院居住的時間總和超過 60 個月。

韋斯特在逝世前 6 年寄信給林奈學會，表示自己受困於健康狀況，無法進行科學活動，只能滿懷遺憾地自請退出。

在文明劇烈變遷的 19 世紀後半葉，不少知名藝術家深受精神症狀所苦。梵谷（V. van Gogh）、孟克（E. Munch）和韋斯特的同胞，愛貓畫家韋恩（L. Wain）。這些藝術家的精神症狀影響繪畫風格，但並未阻止他們繼續創作，甚至成就他們名留青史的傑作。

可惜的是，定位自己為「顯微藝術家」（microscopic artist）而非傳統藝術家的韋斯特，沒能找到精神失調與繪畫結合的創作出口。

繪圖與研究的生產力遠非韋斯特失去的最重要事物，他在即將成為醫師時失去聽力；他在新婚三年後（1860年）不幸喪妻，並在不久後開始進出精神療養院；在 1875 年，他青春期的兒子離開人世。

造化弄人的是，韋斯特分別在喪妻與喪子的年份，獲選為林奈學會成員與郵政顯微協會主席。遭遇精神疾病之後，他的科學繪圖產量從未恢復，但也不曾放棄推廣顯微科學，直到 1891 年逝世前，他仍在持續整理、刊登過去的顯微素描與筆記。

玻片之後的隱形人

58 歲就自稱退休的韋斯特留下不到 1000 件署名作品，沒有水彩畫展、自畫像的紀錄。以當時顯微版畫行情來看，韋斯特很難平衡他的家庭開支，但他留下 500 英鎊的遺產，表示他的報酬可能高出其他顯微繪圖師甚多，或者他還有許多未署名的畫作在維多利亞時代流傳。

如同韋斯特的貢獻在解剖學教科書出版多年後才被哈索爾公布，或是在科普暢銷書的再版生命中逐漸湮沒，功勞被忽略似乎是維多利亞時代顯微繪圖師的常態。隨著科技演進，顯微繪圖這個職業在 20 世紀初不可避免地被顯微攝影取代。

從 19 世紀的博物學到現代學術工作，在科學上得到信賴、美學上得到讚賞的顯微影像，都由許多人的技術與心力交織而成。當精彩的顯微影像映入眼簾，不妨也看看研究主持者之外，還有哪些猶如現代顯微繪圖師的影像技術人員隱藏在這幅微觀風景之後。

參考資料

• Dolan, J. R. (2021). Tuffen West FLS, FRMS (1823-1891): artist of the microscopic, naturalist, and populiser of microscopy. Arts et sciences, 5(1).
• Paisley, P (2015).The Tuffen you probably missed, and some you’ve never seen. microscopy-uk.org
• Paisley, P (2016). More Tuffen you possibly didn’t notice. microscopy-uk.org

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DNA-PAINT：易脫落的奈米「漆」

DNA-PAINT 屬於單分子定位顯微術（SMLM）大家族一員，它突破繞射極限的途徑類似 PALM 與 STORM：以閃爍（blinking）的螢光讓多個目標分子的位置輪番呈現，最後將多次定位影像以電腦疊合重建成完整的超解析分子地圖。結合電腦運算輔助和光學成像的統計原理，DNA-PAINT 可以達成極端細緻的 RESI 定位術，清楚區別兩個距離不到 1 奈米的螢光來源。

單看字面，DNA-PAINT 給人「以 DNA 作為油漆」的印象。事實稍有不同，這種技術以 DNA 作為「點累積奈米成像術」（PAINT , Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography）的探針。接上螢光染劑的短小 DNA 片段，可以靈敏標記蛋白質、染色體以及許多細胞內構造。

DNA-PAINT 的特別之處，在於利用「不牢固」的螢光標記製造閃爍效果。不同於 PALM, STORM 以光調控「固著在目標上」的螢光來源，DNA-PAINT 使用與目標連結力量薄弱的螢光探針，結合目標之後會快速分離。只有在探針與目標結合的瞬間，同時被激發光照射，探針上的螢光團才能發出螢光。目標分子與螢光探針分離後，依然保有和下一個探針結合的能力，因此不必擔心螢光團的放光能力衰退。

DNA-PAINT 使用的 DNA 探針片段長度不超過 10 個鹼基，又稱寡核苷酸（oligonucleotides 或oligomers）。這些短小 DNA 片段可以附加上螢光染劑的螢光團分子，成為螢光探針。

DNA 探針的結合對象是另一段互補的 DNA 片段，此互補序列會預先透過抗體與定位目標連結，等待 DNA 探針前來結合。DNA 探針因為具有螢光團，被稱為「成像片段（imager strand）」，而牢固於目標的互補序列則稱為「嵌合片段（docking strand）」。對生物細胞進行 DNA-PAINT 時，嵌合片段與目標分子之間常有抗體或配體做為銜接，需要類似免疫螢光染色的前置作業，目標表面的抗原也可以因應實驗需求進行設計。

因為兩個短小 DNA 片段之間的結合力有限，成像片段與嵌合片段結合後會快速分離。而螢光團只有在結合目標時才容易放光，因此可以形成閃爍的螢光定位標記。經由電腦疊合閃爍的定位影像，DNA-PAINT 可以達成 10 奈米左右的超解析定位，若沒有序列成像的幫助，依然無法突破奈米以下解析度的光學障礙。

核孔複合體（Nuclear Pore Complex）上的 Nup96 蛋白是科學家經常探索的重要目標，即使是超解析顯微術也未能在自然狀態下呈現其構造。隆曼團隊以 RESI 對 Nup96 進行定位，不但清楚定位出符合電子顯微鏡拍攝的 8 對 Nup96 蛋白沿著核孔形成環狀結構，還能清楚呈現每對蛋白之間的 11 奈米的間距。

結合序列成像（Sequential Imaging）與 DNA-PAINT 兩種技術，RESI 讓科學家得以運用一般門檻的顯微儀器、耗材，就能達到超乎以往想像的定位解析度。而 DNA-PAINT 這種巧妙的定位方法並非一蹴而就，而是數種有趣的技術累積而成。

PAINT 起源：不穩定又不專一的尼羅紅

PAINT（Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography, 點累積奈米成像術）系列定位法的螢光探針由一個螢光染劑分子與一個分子探針（probe）構成。親和性抗體、寡核苷酸（短小 DNA 片段）都可作為分子探針的材料，再由此探針結合目標分子或其上的抗體。除了 DNA-PAINT, PAINT 家譜上還有 FRET-PAINT, Exchange-PAINT, u-PAINT 等不同特質的成員。

在 2006 年由沙羅諾夫（A. Sharonov）和霍克崔瑟（R. M. Hochstraser）發表的第一代 PAINT 中，僅僅使用螢光染料尼羅紅（Nile Red）為標記。這種染劑在含水溶劑中無法發光，必須進入磷脂層等非極性環境才能展現其螢光活性。

因此尼羅紅無須結合探針，只要以低濃度加入樣本溶液中，就能觀察到其進入細胞膜脂雙層、大型磷脂囊泡（large unilamella vesicles）表層等疏水性環境中，受到激發放出螢光。尼羅紅與磷脂層的親和性不強，很快就會再次脫離，也容易遭到光漂白（photobleaching）而失去螢光，因此可作為一種閃爍的螢光定位標記。

尼羅紅可以結合所有疏水性（hydrophobic）的構造，無法真的標記特定分子，缺乏分子生物學重視的專一性。但它開啟了 PAINT 以「不牢固螢光染劑」增進解析度的先河。與多數螢光顯微術追求螢光團穩定性與強度的定位技巧背道而馳。

4 年後，吉安諾內（G. Giannone）和荷西（E. Hosy）以具目標專一性的配體，例如抗體蛋白，連接螢光團形成螢光探針，達成具有專一性的 PAINT 超解析定位。透過進步的生化技術製作配體，這種技術幾乎可以定位所有類型的目標，因此被命名 universal-PAINT, 簡稱 uPAINT。

uPAINT 可以提升多種目標的定位解析度，但其螢光探針即使游離在溶液中，也能接受激發、放出螢光，形成背景雜訊。且結合螢光染劑的抗體無法穿透細胞膜，因此只能定位細胞膜上的目標。

因此 uPAINT 必須限縮激發光照射的範圍，對準目標、減少雜訊，例如微調全內反射顯微鏡（TIRF）的角度，形成「高傾斜層光照明」（Highly Inclined and Laminated Optical sheet, HILO）以限定激發範圍。

同在 2010 年，隆曼與史坦豪爾（C. Steinhauer）嘗試以寡核苷酸為探針，定位 DNA 摺紙構造（DNA origami structure）上的目標，達到了奈米等級的解析度。DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography 正式誕生，善用「不牢固的螢光探針」與電腦運算的輔助，以一般螢光顯微鏡就能突破繞射極限。

無限調色的虛擬油漆：Exchange-PAINT

2014 年，隆曼與同事阿凡達尼歐（M. S. Avendaño）、沃爾斯坦（J. B. Woehrstein）發表 DNA-PAINT 的巧妙變化，除了同時以不同探針標記不同構造，達成精準的多重定位（multiplexed localization），更實現以一種螢光超解析定位多種目標，讓多重標記的潛力加速實現。

這種多重標記被隆曼與同事稱為 Exchange-PAINT，同樣使用 DNA 片段作為探針。在同一個樣本的 10 種不同目標上，連結了 10 種不同的嵌合片段（docking strands），隆曼等人再以 10 種互不干涉的短小 DNA 序列（orthogonal sequences）作為成像片段（imager strands）。

他們每次只加入一種成像片段，針對一種目標進行閃爍（blinking）定位，並由電腦套上特定顏色，接著洗去既有成像片段，再加入下一種成像片段。最後將所有目標的獨立定位圖疊合起來，便能得到完整的奈米級定位。

只需要一種螢光染劑接上多種成像片段，Exchange-PAINT 便能以基本的實驗設備達到多重目標的超解析定位，不像多重標記的 DNA-PAINT 受限於染劑顏色數目，Exchange-PAINT 的門檻在於互不相干寡核甘酸片段的數目，在實驗中幾乎不可能窮盡。而可以使用一般螢光顯微鏡與螢光染劑達到埃（ångström）解析度的 RESI 技術，就是將 Exchange-PAINT 的多種目標定位應用於單種目標定位，透過不同探針標記同種目標製造發光順序落差，大幅提升解析度。

在「眼見為真」的生物學影像趨勢中，「增加偵測光子數量」是螢光顯微技術提升解析度的基礎光學原理，也是最主流的技術改良方向。而 DNA-PAINT 系列技術跳脫了對光子數量的追求，不受螢光染劑的光漂白及螢光壽命限制，以快速脫落的探針另闢蹊徑，使低成本的超解析影像得以實現，更展現生物物理學蘊藏的廣泛技術可能性。

• DNA-PAINT 的最新應用：RESI序列成像解析度增強術
• Jungmann, Ralf, et al.  Nature methods 11.3 (2014): 313-318.
• Agasti, Sarit S., et al.  Chemical science 8.4 (2017): 3080-3091.
• Nieves, Daniel J., Katharina Gaus, and Matthew AB Baker. Genes 9.12 (2018): 621.
• Schlichthaerle, Thomas, et al.  Angewandte Chemie 131.37 (2019): 13138-13142.

本文轉載自顯微觀點

電腦運算是近 20 年來生物影像突破繞射極限的可靠工具，例如 STORM（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）, PALM（Photo-Activated Localization Microscopy），以電腦記憶、疊合，將多次拍攝的零散螢光重建成完整輿圖，解析度極限可接近 10 奈米。

現在，透過電腦輔助的序列成像解析度增強術（RESI, Resolution Enhancement by Sequential Imaging），科學家能將細胞內分子的定位解析度大幅提升到埃（Ångström, Å.等於1/10奈米）的尺度，清晰定位緊鄰的分子、觀察它們在細胞內的變化。

RESI 定位可呈現 DNA 相鄰鹼基間距，超越超解析顯微鏡，達到與電子顯微鏡同等的解析度，而且只需基本的細胞固定，近乎完全保持樣本原貌。

在德國馬克斯．普朗克生化研究所率領團隊研發 RESI 的榮曼（Ralf Jungmann）認為，RESI 能填補介於光學顯微術與結構生物學之間的資訊空白，揭露更多複雜生命系統的真相，為分子生物學與藥物動力學開闢道路。

「發光順序」成為解析度新要素

使 RESI 成為「超級超解析」定位術（super-super resolution）的核心概念，是以不同 DNA 螢光探針對目標進行多次標記定位，定位過程由電腦為目標編上號碼（DNA-barcoding），使「發光順序」成為分辨目標的新維度，並以「定位次數」來大幅提升解析度、為量化分析提供充沛樣本。

例如，淋巴癌與自體免疫疾病的關鍵標靶：B 細胞表面 CD20 蛋白﹐雖然早已發現是重要的癌細胞特徵，也確認有效藥物，但其結構與分子動力學依然曖昧不明，學界對它的了解還不足以研發進一步療法。

儘管 CD20 蛋白的結構已被電子顯微鏡呈現，但電子顯微鏡的拍攝條件會破壞細胞膜結構，導致 CD20 變形、偏移。現在透過 RESI 進行定位，CD20 的構造、藥物效果，都可以在接近生理狀態下一探究竟。

在 RES I分析下，榮曼等學者發現 CD20 總是成對出現（as dimers），並且在關鍵藥物 RTX（一種抗 B 細胞的單株抗體）加入後，會在細胞膜上聚集成緊密的長鏈。這些資訊是過往電子顯微鏡與超解析光學顯微鏡都未曾展現的。

序列成像：以次序換取空間

各種超解析單分子定位術的共同難題，是兩個目標分子過於接近，連電腦運算也無法辨別。假使兩個距離 1 至 2 奈米的相同分子輪流被激發，PALM, STORM 等仰賴隨機放光的超解析定位術即使分別收到兩個光源的螢光訊號，重建時也容易將緊密的兩者混為一點。

榮曼也強調，當兩個螢光團的距離小於 10 奈米，近場光學效應會大幅影響光調控螢光染色分子（photoswitchable fluorescent dyes）的表現。分辨兩個距離數奈米甚至數埃（Å）的分子，是單分子定位技術的最後關卡。

面對諾貝爾級超解析技術也無法克服的障礙，RESI 巧妙地以「標記」技術避開了光學難關。RESI 採用進化版本的 DNA-PAINT，螢光探針與目標結合轉瞬即脫落，並能使相鄰的目標結合不同探針，避免兩者同時發光，兩個緊密的分子幾乎不會干擾彼此成像。

奠基於隨機放光的單分子定位術（SMLM），序列成像（Sequential Imaging）用不同顏色、不同激發光譜的 DNA 螢光探針，標記鄰近的兩個目標，使兩者輪流發光。如此一來，發光順序便成為辨別螢光標記的新方法：兩個目標距離僅 1 奈米左右，但因為發光順序、螢光顏色不同，在重建過程中能夠被電腦清楚區分。

在真實的細胞中，若想以不同嵌合片段（docking strands）標記鄰近的相同蛋白（例如Nup96 dimer, CD20 dimer），則多少需要仰賴運氣。目前的 RESI 使用隨機標記（stochastically labelling），而非直接指定標記種類與位置。

定位 Nup96 的實驗就是一個例子，榮曼團隊的4種嵌合片段中，需要有 2 種分別標記相鄰的 Nup96 蛋白，才能夠使兩個相鄰蛋白分別依序發光。榮曼強調，得到理想標記的機率，會隨著嵌合片段的種類提升。在榮曼團隊的定位實驗中，RESI 對 Nup96 的定位達到和掃描式電子顯微鏡同等精密的解析度。

榮曼認為：「理論上，透過發光順序的差異，RESI 技術可以分辨無限接近的兩點。」

定位次數帶來解析度新境界

基於光波繞射的性質，點光源的光線不會透過顯微鏡聚焦為理想的一點，而是呈現一個立體球狀照射範圍。這個讓科學家困擾一個半世紀的照射範圍，就是此光學系統的點擴散函數（PSF, Point Spread Function）。

在顯微鏡焦平面上，PSF 會形成一個中心最亮、四周漸黯的圓形光斑（艾里斑，Airy Disk），若兩個光點的光斑大幅重疊，就會難以辨別。這也就是遠場光學顯微鏡的最大天然障礙：阿貝繞射極限的由來。

包含 PALM, STORM 等超解析技術的單分子定位顯微術（SMLM, Single-Molecule Localization Microscopy）也必須考慮 PSF。它們定位解析度（也稱定位精準度，σ_SMLM），接近點擴散函數的標準差（σ_Diff）除以每次定位偵測光子數（N）的平方根：

 σ_SMLM ≈ σ_Diff / N^1/2

解析度數值愈小，代表辨別極限的距離愈近，定位結果愈清晰。超解析定位技術不斷追求的，就是縮小 σ_SMLM。

在點擴散函數標準差（σ_Diff）隨儀器性能固定的情況下，每次定位偵測的光子數 N 就是定位解析度的主要變數。多數單分子定位技術，都需要設法提升偵測光子數以看得更清晰。

與其他單分子定位術不同的是，RESI 採用的 DNA-PAINT 探針對目標分子反覆結合、脫落，不斷有新的螢光探針前仆後繼，迅速與目標短暫結合，可以對每個目標累積多次定位。

因此目標的「定位次數」（K）進入解析度數值核心。每個目標定位的解析度由單次定位的點擴散函數標準差（σ_SMLM），轉變為多次放光定位的平均值標準誤差（SEM, Standard Error of the Mean），其大小和定位次數（k）的平方根成反比。

SEM_≈ σ_SMLM / k^1/2 _≈  (σ_Diff / N^1/2) / k^1/2

此時只要提升定位次數（k），就可以得到更精密的定位（σ_RESI），毋須追求更強或更漫長的螢光來增加每次偵測的光子數（N）。再搭配以定位順序區分鄰近分子，RESI 就能得到近乎無限小的解析度。這種靈活的反覆定位模式，有賴 DNA-PAINT 技術奇特的「不牢固」結合（transient binding）搭配榮曼團隊研發的開源影像處理軟體Picasso 合力實現。

（DNA-PAINT 技術介紹請見：DNA-PAINT：短暫標記 奈米解析）

• Reinhardt, S.C.M., Masullo, L.A., Baudrexel, I. et al. Ångström-resolution fluorescence microscopy. Nature 617, 711–716 (2023).
• Max-Planck-Gesellshft. Ångström-resolution fluorescence microscopy. (2023)
• Agasti SS, Wang Y, et al. DNA-barcoded labeling probes for highly multiplexed Exchange-PAINT imaging. Chem Sci. 2017 Apr 1;8(4):3080-3091.