馬蘭托(Robert Maranto)是第一個成功在電子顯微鏡下觀察到螢光分子的科學家。早在 1982 年,他率先在光學顯微鏡下觀察注射了螢光黃(Lucifer yellow)染劑的神經細胞,接著將切片浸泡在含二氨基聯苯胺(diaminobenzidine, DAB)的溶液中,並以藍光照射切片,被激發的螢光黃分子釋出自由基促使 DAB 氧化,由於氧化的 DAB 形成的沉澱物可以與重金屬鋨酸結合,因此成功在電子顯微鏡下看到原本螢光黃所在區域出現許多電子緻密的沉澱物。
然而,攜帶黃金顆粒的抗體分子較大,在已固定的細胞或組織間滲透效果不好,限制了使用的範圍。雖然這問題可以改用上述氧化 DAB 產生電子緻密產物的方式解決,也就是讓抗體帶有可氧化 DAB 的染劑或酵素,或是直接以基因轉殖方式,使欲觀察的蛋白質與螢光蛋白結合,這些方法解決了大分子不易滲透的問題,但是原來電子顯微鏡下的影像就是黑白,沉積的產物也是黑色,反而增加了辨識的難度。
反應後的切片依電子顯微鏡樣本製備方式處理後,在一般穿透式電子顯微鏡下,可以觀察細胞內細微的各式結構,但此時不管何種帶鑭系元素的 DAB 產物,在顯微鏡下還是不容易和其他深染構造區分。作者接著以加裝了「電子能量損失能譜儀(Electron energy loss spectroscopy, EELS)」的電子顯微鏡觀察樣本,分析切片中兩種鑭系元素訊號分別出自何處,得到兩種元素的分佈圖,最後將傳統電子顯微鏡影像與兩種鑭系元素分佈圖於繪圖軟體中重疊在一起,並為元素分佈圖套色,使各自帶有不同顏色,如綠色代表鑭,紅色代表鈰,於是得到黑白的電子顯微鏡照片上有綠色和紅色等色彩的呈現。
作者選擇鑭系元素有幾個原因,一是他們都是重金屬,在 EELS 元素分析下訊號容易辨識,另一個則是在 DAB 氧化時易一起形成沉澱且不易流失。嚴格說來,作者並非直接在電子顯微鏡下看到彩色的影像,畢竟成像的還是電子,不是光子。不過本篇文章採用的技術,讓我們可以先利用光學顯微鏡及螢光蛋白科技等優勢,觀察大範圍組織獲得較整體的概念,再藉由電子顯微鏡的高解析度了解奈米層級的結構,同時對標定的分子在細胞內的分佈狀況或交互作用,能藉由顏色的呈現更清楚的與背景影像區別,這對未來細胞顯微結構及分子分佈與功能的研究開啟了另一種可能性。
1990 年,融合蛋白 CD4 免疫黏附素(CD4 immunoadhesin)誕生。這項設計,是為了對付令人類聞風喪膽的 HIV 病毒。
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我們知道 T 細胞是人體中一種非常重要的白血球。在這些 T 細胞中,大約有六到七成表面帶有一個叫做「CD4」的輔助受體。CD4 會和另一個受體 TCR 一起合作,幫助 T 細胞辨識其他細胞表面的抗原片段,等於是 T 細胞用來辨認壞人的「探測器」。表面擁有 CD4 受體的淋巴球,就稱為 CD4 淋巴球。
麻煩的來了。 HIV 病毒反將一軍,竟然把 T 細胞的 CD4 探測器,當成了自己辨識獵物的「標記」。沒錯,對 HIV 病毒來說,免疫細胞就是它的獵物。HIV 的表面有一種叫做 gp120 的蛋白,會主動去抓住 T 細胞上的 CD4 受體。
而另一端的 Fc 區域則有兩個重要作用:一是延長融合蛋白在體內的存活時間;二是理論上能掛上「這裡有敵人!」的標籤,這種機制稱為抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)或免疫吞噬作用(ADCP)。當免疫細胞的 Fc 受體與 Fc 區域結合,就能促使免疫細胞清除被黏住的病毒顆粒。
不過,這裡有個關鍵細節。
在實際設計中,CD4免疫黏附素的 Fc 片段通常會關閉「吸引免疫細胞」的這個技能。原因是:HIV 專門攻擊的就是免疫細胞本身,許多病毒甚至已經藏在 CD4 細胞裡。若 Fc 區域過於活躍,反而可能引發強烈的發炎反應,甚至讓免疫系統錯把帶有病毒碎片的健康細胞也一併攻擊,這樣副作用太大。因此,CD4 免疫黏附素的 Fc 區域會加入特定突變,讓它只保留延長藥物壽命的功能,而不會與淋巴球的 Fc 受體結合,以避免誘發免疫反應。
從 DNA 藍圖到生物積木:融合蛋白的設計巧思
融合蛋白雖然潛力強大,但要製造出來可一點都不簡單。它並不是用膠水把兩段蛋白質黏在一起就好。「融合」這件事,得從最根本的設計圖,也就是 DNA 序列就開始規劃。
我們體內的大部分蛋白質,都是細胞照著 DNA 上的指令一步步合成的。所以,如果科學家想把蛋白 A 和蛋白 B 接在一起,就得先把這兩段基因找出來,然後再「拼」成一段新的 DNA。