奈米科技讓光學隱形裝置的發展更進一步

本文轉載自顯微觀點

主持台大生醫光學實驗室的朱士維，在 2023 年初兼任台大學務長。他一面落實以學生為核心的大學價值，一面持續鑽研光學與生物組織、奈米結構的互動。

近年朱士維參與的研究包含觀察「活的小鼠大腦」如何自我調節、以光激發出奈米材料的新物理性質等。這些研究登上《自然通訊》（Nature Communication）、《先進科學》（Advanced Science）等重要期刊，以尖端光學技術為腦科學、奈米材料探照未知之處。

對於生醫領域的精密光學應用，朱士維說明，光學顯微技術介於醫學造影和電子顯微鏡之間：醫學造影提供即時成像，但解析度不夠精密。電子顯微鏡可以達到奈米解析度，卻無法保持樣本活性。而持續發展的光學顯微術則開始達成快速的高解析度活體影像，讓科學家看到真實生理。

活體顯微影像的追求不出四大方向：對比、解析度、穿透深度、速度。

– 朱士維

雙光子顯微術搭配人工智慧 追上神經生理

2024 年，朱士維領銜的台大、清大聯合團隊研發高速體積成像系統 TAG-SPARK (TAG-lens-based SPAtial redundancy-driven noise Reduction Kernel)，以可調式聲學梯度變焦透鏡（Tunable Acoustic Gradient, TAG lens）結合自我監督式深度學習演算法，顯微影像成果比單用雙光子顯微術清晰 10 倍，掃描速度快上近 1000 倍。

TAG-SPARK 的聲學梯度變焦透鏡，以聲波控制特殊透鏡內的液體振動、改變折射率，使雙光子顯微光路可以在 1 秒內完成多個深度的對焦，快速建立 3D 影像。在高速體積成像的支援下，研究團隊設計的演算法利用每層平面影像間豐沛的空間冗餘（spatial redundancy）資訊進行去噪（noise reduction），讓影像訊噪比改善7倍以上。

高速度和高品質的立體顯微影像，讓科學家以接近神經運作的速率，觀察活體小鼠的小腦動態。研究團隊以小腦中的柏金氏細胞（Purkinje cells）作為觀察目標，它們是小腦皮層唯一的輸出神經元，掌控小腦的訊號傳輸與身體日常運作。柏金氏神經細胞的樹突緻密分布於小腦皮質最外側的分子層（molecular layer），細胞體則聚集在更深處的分子層與顆粒細胞層（granule cell layer）之間，獨立形成柏金氏層。

傳統顯微方法不易穿透其深度觀察細胞體動態，若使用共軛焦顯微術，強力激發光卻容易傷害腦細胞。但雙光子顯微術在觀察活體組織時，則可以提供較深的焦平面和較低的光毒性。

透過 TAG-SPARK, 研究團隊不僅詳細記錄柏金氏細胞動態，更發現相同的樹突訊號能導致柏金氏細胞體產生不同反應，呈現前所未見的有趣訊號模式。朱士維相信「意識是資訊的集合」，高速立體光學成像系統能讓我們看見腦中資訊的聚散，更進一步接近「何謂意識」這個世紀之謎。

朱士維也參與由台大生科系教授陳示國領導的跨校團隊，以雙光子顯微術結合梯度折射（Gradient-Index, GRIN, 物鏡內有不同折射率的微型透鏡平行排列）內視鏡，觀察小鼠的晝夜節律神經系統的真實運作狀況。

這支結合生命科學、物理以及工程科學的研究團隊測試大腦底部「視交叉上核」（suprachiasmatic nucleus，SCN）神經細胞對光線變化的反應。在團隊中，朱士維負責提供精密顯微影像，研究活體腦神經元生理不可或缺的觀察工具。

團隊利用朱士維研發的雙光子-GRIN顯微內視鏡（雙光子顯微術搭配GRIN內視鏡），從樹突叢集的鼠腦表層看進神經細胞體聚集處。他們發現，即使樹突受到相同光訊號刺激，節律神經細胞體可能以不同的方式回應，並由複數神經元整合資訊，再行輸出訊號給下游神經元。

研究團隊認為，在多種神經元的交織協力下，晝夜節律的神經生理呈現高度動態變化。神經細胞活動與光照的關係並非傳統想像的線性模式，而是雙穩態（bi-stability, 系統中有 2 個調節開關）的靈活調控，而單一類型神經細胞對光照的反應難以預測，生理時鐘內還有許多奧秘等待探索。

與跨領域學者合作，並非一帆風順。朱士維坦言，跨足生物學領域，他還有很多知識要補充、溝通門檻要跨越。

他笑稱，「光是合作對象經常討論的果蠅蕈狀體，我聽了 3 年才認為自己真的懂了。」對他來說，跨領域合作最重要的收穫之一，就是尊重不同領域之間的知識含量。其次，則是溝通的技術。

我維持了幾年的一知半解才了解合作對象的語言，那我務必要讓自己說出來的話非常容易理解。

– 朱士維

除了生醫應用，朱士維也在物理工程領域探索新的光學現象。他與中國、日本學者合作研究奈米材料上的非線性光學，發現與米氏散射原理相關的移位共振，能夠激發矽奈米結構的多極模態（multipolar modes）。

透過共軛焦反射顯微鏡光路達成的多極模態，讓奈米材料展現幾項嶄新的光學效應，如更低的光學非線性閾值、光開關的訊號反轉（sign flip）、空間解析度提升等。不僅開啟了操控米氏共振的新方法，也擴張了超過百年的經典光散射理論。

這些精采研究涵蓋跨領域、跨國界的合作，並非巧合，而是出於朱士維的世界觀。他深信，「真實世界的所有問題，都是跨領域問題。」在大學教室裡，他也以此觀念為學生設定學習方向。

討論與實作優先的大學教育

在大一、大二的基礎課程中，朱士維就會要求學生提出研究計畫、動手進行研發。他強調，讓學生從具體而明確的問題出發，親手進行研究。在研究中遇到挑戰、企圖解決時，學生自然會尋找需要的知識。

朱士維回想，「修課學生果然從很務實的角度發想，有人的提案是『保證起床的鬧鐘』，結合物理知識和現實可行的元件，做出不會被輕易關掉的鬧鐘，讓他可以準時上課。他在學期末真的做出了這個鬧鐘。」

朱士維認為，在豐富的現代資訊環境中，幾乎所有理論知識都可以線上學習，在教室上實體課程的必要性遠不如以往。至於實體課程最珍貴的部份是讓人當面討論、激盪想法，讓積極學習的學生們能夠聚集、交流，而非要求學生安靜聽課、被動吸收。

朱士維相信，大學教育的重要目標之一，是訓練學生主動採取行動的習慣，並讓他們知道必須主動追求，才能完成自己心中的期待。因此親自規畫、動手（腳）實踐，是他所有課程的必備基礎。

除了物理系，朱士維也在臺大創新設計學院（College of Design and Innovation，簡稱 D-School）開設課程，引導學生以「設計師」、「使用者」觀點建構自己的大學生活與生涯規劃。

朱士維特別說明，D-School 設有創新領域學士學位學程，讓學生能夠跳脫舊有領域框架自訂學習主題。讓學生能實現自己對知識的構想，或許比舊有科系分野更能適應快速變化的社會。他強調，「學生原創的課程組合，是可以得到學士學位的。」

主修社團，副修電機

談及學習經驗，朱士維說，「我常常說自己大學主修『嚕啦啦社』，副修電機系。大學4年中至少有1年在山上過，成績排名也因此往往是後半段。」但他認為，自己重要的「能力」如溝通協調、事前規劃、親手解決問題的信念，都是在社團經歷中學到的。

朱士維回想，他在高中時參與了救國團服務隊舉辦的山區營隊，活動內容相當刻苦簡樸，但他十分羨慕服務隊成員們能住在優美山林間，心想「等我上大學，一定要成為其中一員。」

進入台大嚕啦啦社並擔任服務隊員後，朱士維不僅培養了在山野間帶隊行進的嚮導經驗，也經常為了團康活動面對群眾。他說，「服務員經常得一手掌握團隊氣氛，活動才會成功。」他回想，當年為了達到這樣的能力，投入許多時間認真練習，經過跌跌撞撞的多次嚐試，才塑造出自己的風格。

後來得到「優良導師」與多次「教學優良教師」獎項的朱士維分析，這種能力其實就是「溝通」。但是他當時並非盤算著，「有天我會成為教師，能把這種技巧發揮在教室裡。」而是對當下的任務很投入，進行一件自己真的很想做的事情，在過程中內化了這項能力。

做學術研究不可或缺的計畫書，我也是在社團學到怎麼寫的，因為當時想申請更多經費來辦活動。朱士維

因為自身經歷，朱士維相信，讓學生能投入自己真的想做的事情，才能培養長期的能力與素養。為了帶給學生自由探索的時間與空間，朱士維也強力支持 D-School 中的「探索學習」計畫。

選擇「探索學習」的學生，不再受到學期學分下限要求，可以自行前往校園外進行探索，建構自己的志向與經驗。選擇此計畫的學生，有人加入 NGO、有人進入動物園與馬場實習，還有人搭乘無動力帆船橫跨大洋，獲得課堂中無法給予的重要體驗。

朱士維認為，親身體驗，遠比聽講的學習效果更好。而離開校園探索世界的深刻體驗，未必會讓人遠離學術。

提及學術起點，朱士維不好意思地說，當年之所以報考台大光電研究所，「是因為想要繼續參加社團，要是離開台大，社團生涯就結束了。」

研究所開學不久，921 大地震撼動台灣，中部災情尤其嚴重。朱士維聽聞大學時期經常前往、充滿熟悉與認同的南投山區也遭受重創，便和指導老師孫啟光請假，前往災區協助賑災。

朱士維回憶，孫啟光乾脆地答應他的請求，即使他離校超過一個月才回歸實驗室，也不曾額外施加壓力。經過了在南投山區鎮日搬運物資、不時目擊傷亡狀況的賑災經驗，他回到台大光電研究所時，同學們大多已在研究軌道上運作。

朱士維說，「當時我並沒有對研究成果想太多，而是想回報孫老師。因為他給我很大的彈性、研究主題又有趣，就專心投入他的計畫。想不到，幾個月後研究成果竟登上國際期刊。至今我還記得看到自己名列期刊之中的感動，也在那時開始覺得『我或許可以走學術這條路！』」

因為充滿因緣際會的生涯際遇，朱士維相信，「全心投入的事情，都會在生涯某處開花結果。比起嚴密生涯規畫更重要的，是當下的自己、周遭的人與環境，找到自己想投入的事情。」

從「好好生活」出發的學務長

一進入朱士維的學務長辦公室，能看到一幅對聯「好好生活。感恩助人」，書桌後方則並列三幅春聯「好好生活」、「好好吃飯」、「好好睡覺」。

朱士維說，學務處實際上掌管學生除了成績外的所有在校事務，而大學除了學業成績外，更應該協助學生培養人格和價值觀。因此，他將學務處設定為學生在校期間的支持與賦能來源。

台大學務處網站上的理念「好好生活，吃飯睡覺運動交友；感恩助人，學生互助回饋社會。」就是朱士維為學務處設立的目標。他強調，將學生推向世界，能夠與自身、週遭人事物建立真實的連結，是比追求課業成績更優先的大學價值。

因此他規劃學務處擴改善硬體設施、增加軟體服務，從社團資源、宿舍、餐廳、心輔中心到新的經濟支持計畫，提供學生友善、包容的生活環境。他期待學生能夠在生活中感到安定，進而察覺值得感恩的事，得到感激並協助他人的能力，形成助人的循環。

朱士維回想，自己在台大的社團與求學經驗都讓他心懷感恩，包括在台大擔任教師也是非常幸運的事。現在，他致力為台大學生建立可以安心探索自我與真實世界的大學環境，以充滿感動的學習經驗，取代孤獨且競爭激烈的人生賽道。

本文轉載自顯微觀點

DNA-PAINT：易脫落的奈米「漆」

DNA-PAINT 屬於單分子定位顯微術（SMLM）大家族一員，它突破繞射極限的途徑類似 PALM 與 STORM：以閃爍（blinking）的螢光讓多個目標分子的位置輪番呈現，最後將多次定位影像以電腦疊合重建成完整的超解析分子地圖。結合電腦運算輔助和光學成像的統計原理，DNA-PAINT 可以達成極端細緻的 RESI 定位術，清楚區別兩個距離不到 1 奈米的螢光來源。

單看字面，DNA-PAINT 給人「以 DNA 作為油漆」的印象。事實稍有不同，這種技術以 DNA 作為「點累積奈米成像術」（PAINT , Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography）的探針。接上螢光染劑的短小 DNA 片段，可以靈敏標記蛋白質、染色體以及許多細胞內構造。

DNA-PAINT 的特別之處，在於利用「不牢固」的螢光標記製造閃爍效果。不同於 PALM, STORM 以光調控「固著在目標上」的螢光來源，DNA-PAINT 使用與目標連結力量薄弱的螢光探針，結合目標之後會快速分離。只有在探針與目標結合的瞬間，同時被激發光照射，探針上的螢光團才能發出螢光。目標分子與螢光探針分離後，依然保有和下一個探針結合的能力，因此不必擔心螢光團的放光能力衰退。

DNA-PAINT 使用的 DNA 探針片段長度不超過 10 個鹼基，又稱寡核苷酸（oligonucleotides 或oligomers）。這些短小 DNA 片段可以附加上螢光染劑的螢光團分子，成為螢光探針。

DNA 探針的結合對象是另一段互補的 DNA 片段，此互補序列會預先透過抗體與定位目標連結，等待 DNA 探針前來結合。DNA 探針因為具有螢光團，被稱為「成像片段（imager strand）」，而牢固於目標的互補序列則稱為「嵌合片段（docking strand）」。對生物細胞進行 DNA-PAINT 時，嵌合片段與目標分子之間常有抗體或配體做為銜接，需要類似免疫螢光染色的前置作業，目標表面的抗原也可以因應實驗需求進行設計。

因為兩個短小 DNA 片段之間的結合力有限，成像片段與嵌合片段結合後會快速分離。而螢光團只有在結合目標時才容易放光，因此可以形成閃爍的螢光定位標記。經由電腦疊合閃爍的定位影像，DNA-PAINT 可以達成 10 奈米左右的超解析定位，若沒有序列成像的幫助，依然無法突破奈米以下解析度的光學障礙。

核孔複合體（Nuclear Pore Complex）上的 Nup96 蛋白是科學家經常探索的重要目標，即使是超解析顯微術也未能在自然狀態下呈現其構造。隆曼團隊以 RESI 對 Nup96 進行定位，不但清楚定位出符合電子顯微鏡拍攝的 8 對 Nup96 蛋白沿著核孔形成環狀結構，還能清楚呈現每對蛋白之間的 11 奈米的間距。

結合序列成像（Sequential Imaging）與 DNA-PAINT 兩種技術，RESI 讓科學家得以運用一般門檻的顯微儀器、耗材，就能達到超乎以往想像的定位解析度。而 DNA-PAINT 這種巧妙的定位方法並非一蹴而就，而是數種有趣的技術累積而成。

PAINT 起源：不穩定又不專一的尼羅紅

PAINT（Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography, 點累積奈米成像術）系列定位法的螢光探針由一個螢光染劑分子與一個分子探針（probe）構成。親和性抗體、寡核苷酸（短小 DNA 片段）都可作為分子探針的材料，再由此探針結合目標分子或其上的抗體。除了 DNA-PAINT, PAINT 家譜上還有 FRET-PAINT, Exchange-PAINT, u-PAINT 等不同特質的成員。

在 2006 年由沙羅諾夫（A. Sharonov）和霍克崔瑟（R. M. Hochstraser）發表的第一代 PAINT 中，僅僅使用螢光染料尼羅紅（Nile Red）為標記。這種染劑在含水溶劑中無法發光，必須進入磷脂層等非極性環境才能展現其螢光活性。

因此尼羅紅無須結合探針，只要以低濃度加入樣本溶液中，就能觀察到其進入細胞膜脂雙層、大型磷脂囊泡（large unilamella vesicles）表層等疏水性環境中，受到激發放出螢光。尼羅紅與磷脂層的親和性不強，很快就會再次脫離，也容易遭到光漂白（photobleaching）而失去螢光，因此可作為一種閃爍的螢光定位標記。

尼羅紅可以結合所有疏水性（hydrophobic）的構造，無法真的標記特定分子，缺乏分子生物學重視的專一性。但它開啟了 PAINT 以「不牢固螢光染劑」增進解析度的先河。與多數螢光顯微術追求螢光團穩定性與強度的定位技巧背道而馳。

4 年後，吉安諾內（G. Giannone）和荷西（E. Hosy）以具目標專一性的配體，例如抗體蛋白，連接螢光團形成螢光探針，達成具有專一性的 PAINT 超解析定位。透過進步的生化技術製作配體，這種技術幾乎可以定位所有類型的目標，因此被命名 universal-PAINT, 簡稱 uPAINT。

uPAINT 可以提升多種目標的定位解析度，但其螢光探針即使游離在溶液中，也能接受激發、放出螢光，形成背景雜訊。且結合螢光染劑的抗體無法穿透細胞膜，因此只能定位細胞膜上的目標。

因此 uPAINT 必須限縮激發光照射的範圍，對準目標、減少雜訊，例如微調全內反射顯微鏡（TIRF）的角度，形成「高傾斜層光照明」（Highly Inclined and Laminated Optical sheet, HILO）以限定激發範圍。

同在 2010 年，隆曼與史坦豪爾（C. Steinhauer）嘗試以寡核苷酸為探針，定位 DNA 摺紙構造（DNA origami structure）上的目標，達到了奈米等級的解析度。DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography 正式誕生，善用「不牢固的螢光探針」與電腦運算的輔助，以一般螢光顯微鏡就能突破繞射極限。

無限調色的虛擬油漆：Exchange-PAINT

2014 年，隆曼與同事阿凡達尼歐（M. S. Avendaño）、沃爾斯坦（J. B. Woehrstein）發表 DNA-PAINT 的巧妙變化，除了同時以不同探針標記不同構造，達成精準的多重定位（multiplexed localization），更實現以一種螢光超解析定位多種目標，讓多重標記的潛力加速實現。

這種多重標記被隆曼與同事稱為 Exchange-PAINT，同樣使用 DNA 片段作為探針。在同一個樣本的 10 種不同目標上，連結了 10 種不同的嵌合片段（docking strands），隆曼等人再以 10 種互不干涉的短小 DNA 序列（orthogonal sequences）作為成像片段（imager strands）。

他們每次只加入一種成像片段，針對一種目標進行閃爍（blinking）定位，並由電腦套上特定顏色，接著洗去既有成像片段，再加入下一種成像片段。最後將所有目標的獨立定位圖疊合起來，便能得到完整的奈米級定位。

只需要一種螢光染劑接上多種成像片段，Exchange-PAINT 便能以基本的實驗設備達到多重目標的超解析定位，不像多重標記的 DNA-PAINT 受限於染劑顏色數目，Exchange-PAINT 的門檻在於互不相干寡核甘酸片段的數目，在實驗中幾乎不可能窮盡。而可以使用一般螢光顯微鏡與螢光染劑達到埃（ångström）解析度的 RESI 技術，就是將 Exchange-PAINT 的多種目標定位應用於單種目標定位，透過不同探針標記同種目標製造發光順序落差，大幅提升解析度。

在「眼見為真」的生物學影像趨勢中，「增加偵測光子數量」是螢光顯微技術提升解析度的基礎光學原理，也是最主流的技術改良方向。而 DNA-PAINT 系列技術跳脫了對光子數量的追求，不受螢光染劑的光漂白及螢光壽命限制，以快速脫落的探針另闢蹊徑，使低成本的超解析影像得以實現，更展現生物物理學蘊藏的廣泛技術可能性。

參考資料：

• DNA-PAINT 的最新應用：RESI序列成像解析度增強術
• Jungmann, Ralf, et al.  Nature methods 11.3 (2014): 313-318.
• Agasti, Sarit S., et al.  Chemical science 8.4 (2017): 3080-3091.
• Nieves, Daniel J., Katharina Gaus, and Matthew AB Baker. Genes 9.12 (2018): 621.
• Schlichthaerle, Thomas, et al.  Angewandte Chemie 131.37 (2019): 13138-13142.

本文轉載自顯微觀點

電腦運算是近 20 年來生物影像突破繞射極限的可靠工具，例如 STORM（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）, PALM（Photo-Activated Localization Microscopy），以電腦記憶、疊合，將多次拍攝的零散螢光重建成完整輿圖，解析度極限可接近 10 奈米。

現在，透過電腦輔助的序列成像解析度增強術（RESI, Resolution Enhancement by Sequential Imaging），科學家能將細胞內分子的定位解析度大幅提升到埃（Ångström, Å.等於1/10奈米）的尺度，清晰定位緊鄰的分子、觀察它們在細胞內的變化。

RESI 定位可呈現 DNA 相鄰鹼基間距，超越超解析顯微鏡，達到與電子顯微鏡同等的解析度，而且只需基本的細胞固定，近乎完全保持樣本原貌。

在德國馬克斯．普朗克生化研究所率領團隊研發 RESI 的榮曼（Ralf Jungmann）認為，RESI 能填補介於光學顯微術與結構生物學之間的資訊空白，揭露更多複雜生命系統的真相，為分子生物學與藥物動力學開闢道路。

「發光順序」成為解析度新要素

使 RESI 成為「超級超解析」定位術（super-super resolution）的核心概念，是以不同 DNA 螢光探針對目標進行多次標記定位，定位過程由電腦為目標編上號碼（DNA-barcoding），使「發光順序」成為分辨目標的新維度，並以「定位次數」來大幅提升解析度、為量化分析提供充沛樣本。

例如，淋巴癌與自體免疫疾病的關鍵標靶：B 細胞表面 CD20 蛋白﹐雖然早已發現是重要的癌細胞特徵，也確認有效藥物，但其結構與分子動力學依然曖昧不明，學界對它的了解還不足以研發進一步療法。

儘管 CD20 蛋白的結構已被電子顯微鏡呈現，但電子顯微鏡的拍攝條件會破壞細胞膜結構，導致 CD20 變形、偏移。現在透過 RESI 進行定位，CD20 的構造、藥物效果，都可以在接近生理狀態下一探究竟。

在 RES I分析下，榮曼等學者發現 CD20 總是成對出現（as dimers），並且在關鍵藥物 RTX（一種抗 B 細胞的單株抗體）加入後，會在細胞膜上聚集成緊密的長鏈。這些資訊是過往電子顯微鏡與超解析光學顯微鏡都未曾展現的。

序列成像：以次序換取空間

各種超解析單分子定位術的共同難題，是兩個目標分子過於接近，連電腦運算也無法辨別。假使兩個距離 1 至 2 奈米的相同分子輪流被激發，PALM, STORM 等仰賴隨機放光的超解析定位術即使分別收到兩個光源的螢光訊號，重建時也容易將緊密的兩者混為一點。

榮曼也強調，當兩個螢光團的距離小於 10 奈米，近場光學效應會大幅影響光調控螢光染色分子（photoswitchable fluorescent dyes）的表現。分辨兩個距離數奈米甚至數埃（Å）的分子，是單分子定位技術的最後關卡。

面對諾貝爾級超解析技術也無法克服的障礙，RESI 巧妙地以「標記」技術避開了光學難關。RESI 採用進化版本的 DNA-PAINT，螢光探針與目標結合轉瞬即脫落，並能使相鄰的目標結合不同探針，避免兩者同時發光，兩個緊密的分子幾乎不會干擾彼此成像。

奠基於隨機放光的單分子定位術（SMLM），序列成像（Sequential Imaging）用不同顏色、不同激發光譜的 DNA 螢光探針，標記鄰近的兩個目標，使兩者輪流發光。如此一來，發光順序便成為辨別螢光標記的新方法：兩個目標距離僅 1 奈米左右，但因為發光順序、螢光顏色不同，在重建過程中能夠被電腦清楚區分。

在真實的細胞中，若想以不同嵌合片段（docking strands）標記鄰近的相同蛋白（例如Nup96 dimer, CD20 dimer），則多少需要仰賴運氣。目前的 RESI 使用隨機標記（stochastically labelling），而非直接指定標記種類與位置。

定位 Nup96 的實驗就是一個例子，榮曼團隊的4種嵌合片段中，需要有 2 種分別標記相鄰的 Nup96 蛋白，才能夠使兩個相鄰蛋白分別依序發光。榮曼強調，得到理想標記的機率，會隨著嵌合片段的種類提升。在榮曼團隊的定位實驗中，RESI 對 Nup96 的定位達到和掃描式電子顯微鏡同等精密的解析度。

榮曼認為：「理論上，透過發光順序的差異，RESI 技術可以分辨無限接近的兩點。」

定位次數帶來解析度新境界

基於光波繞射的性質，點光源的光線不會透過顯微鏡聚焦為理想的一點，而是呈現一個立體球狀照射範圍。這個讓科學家困擾一個半世紀的照射範圍，就是此光學系統的點擴散函數（PSF, Point Spread Function）。

在顯微鏡焦平面上，PSF 會形成一個中心最亮、四周漸黯的圓形光斑（艾里斑，Airy Disk），若兩個光點的光斑大幅重疊，就會難以辨別。這也就是遠場光學顯微鏡的最大天然障礙：阿貝繞射極限的由來。

包含 PALM, STORM 等超解析技術的單分子定位顯微術（SMLM, Single-Molecule Localization Microscopy）也必須考慮 PSF。它們定位解析度（也稱定位精準度，σ_SMLM），接近點擴散函數的標準差（σ_Diff）除以每次定位偵測光子數（N）的平方根：

 σ_SMLM ≈ σ_Diff / N^1/2

解析度數值愈小，代表辨別極限的距離愈近，定位結果愈清晰。超解析定位技術不斷追求的，就是縮小 σ_SMLM。

在點擴散函數標準差（σ_Diff）隨儀器性能固定的情況下，每次定位偵測的光子數 N 就是定位解析度的主要變數。多數單分子定位技術，都需要設法提升偵測光子數以看得更清晰。

與其他單分子定位術不同的是，RESI 採用的 DNA-PAINT 探針對目標分子反覆結合、脫落，不斷有新的螢光探針前仆後繼，迅速與目標短暫結合，可以對每個目標累積多次定位。

因此目標的「定位次數」（K）進入解析度數值核心。每個目標定位的解析度由單次定位的點擴散函數標準差（σ_SMLM），轉變為多次放光定位的平均值標準誤差（SEM, Standard Error of the Mean），其大小和定位次數（k）的平方根成反比。

SEM_≈ σ_SMLM / k^1/2 _≈  (σ_Diff / N^1/2) / k^1/2

此時只要提升定位次數（k），就可以得到更精密的定位（σ_RESI），毋須追求更強或更漫長的螢光來增加每次偵測的光子數（N）。再搭配以定位順序區分鄰近分子，RESI 就能得到近乎無限小的解析度。這種靈活的反覆定位模式，有賴 DNA-PAINT 技術奇特的「不牢固」結合（transient binding）搭配榮曼團隊研發的開源影像處理軟體Picasso 合力實現。

（DNA-PAINT 技術介紹請見：DNA-PAINT：短暫標記 奈米解析）

參考資料

• Reinhardt, S.C.M., Masullo, L.A., Baudrexel, I. et al. Ångström-resolution fluorescence microscopy. Nature 617, 711–716 (2023).
• Max-Planck-Gesellshft. Ångström-resolution fluorescence microscopy. (2023)
• Agasti SS, Wang Y, et al. DNA-barcoded labeling probes for highly multiplexed Exchange-PAINT imaging. Chem Sci. 2017 Apr 1;8(4):3080-3091.