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抗輻射奈米碳管電晶體現身

NanoScience
・2012/10/21 ・834字 ・閱讀時間約 1 分鐘 ・SR值 555 ・八年級

美國研究人員發現,採用氮氧化矽(SiON)閘極介電層的單壁式奈米碳管(single-walled carbon nanotube, SWCNT)電晶體可以抵抗劑量高達2 Mrad的伽瑪射線(gamma radiation),因此可能適合在惡劣的太空游離環境中使用。

一般的SWCNT薄膜電晶體和矽基場效電晶體都容易受到游離輻射(ionizing radiation)的影響,原因是元件中的二氧化矽閘極介電層會捕捉電洞。為克服這個問題,美國海軍研究實驗室(Naval Research Laboratory)的Cory Cress等人研發出抗輻射(radiation-hardened)SWCNT薄膜電晶體,他們採用氮氧化矽做為閘極介電層,該材料一來捕獲的載子較少,二來傾向捕捉等量的電子與電洞,由於無淨電荷累積,因此比較不受輻射影響。

地球磁場將高能帶電粒子侷限在兩道環形輻射帶中,稱為范艾倫輻射帶(Van Allen belt)。太空船繞行地球時,會重複經過這些輻射帶並且暴露於高劑量的高能電子與質子游離輻射中。Cress表示,這些輻射的能譜與入射角度相當均勻,因此可以藉由鈷六十(Co-60)在實驗室中模擬此劑量。

伽瑪射線會迅速激發碳管的電子,然後快速鬆弛,因此不至損傷碳管。不過當受激電子的能量超過碳管的位移閥值(displacement threshold, 約為90-120 keV)時,碳原子便可能脫離晶格,造成碳管的晶格結構受損。然而實驗結果顯示,他們的元件在2 Mrad的輻射劑量下發生這些情形的機率極為微小。

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大部分的多數載子電子元件暴露於輻射環境時,閘極介電層及絕緣層會捕捉電荷載子,造成元件效能下降。而他們研發的抗輻射SWCNT薄膜電晶體卻不受影響,原因是該元件是以擴散傳輸方式運作,電荷載子會因鄰近缺陷而成倍數散射,這些缺陷包含碳管晶格缺陷、碳管邊界及聲子等,都會影響電荷傳輸以及奈米碳管元件對輻射的反應。

未來SWCNT場效電晶體將具有短通道,載子在元件內將呈彈道式傳輸,因此碳管-金屬接觸間的性質在元件效能上將扮演著更重要的角色,值得更進一步的研究。該團隊未來的研究重點將放在操作於彈道傳輸區域的電晶體元件。詳見Electronics |doi:10.3390/electronics1010023。

資料來源:Lift off for nanotube transistors. NanoTechWeb [Sep 28, 2012]

譯者:莫偉呈(茂迪太陽能)
責任編輯:蔡雅芝

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轉載自 奈米科學網

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NanoScience
68 篇文章 ・ 4 位粉絲
主要任務是將歐美日等國的尖端奈米科學研究成果以中文轉譯即時傳遞給國人,以協助國內研發界掌握最新的奈米科技脈動,同時也有系統地收錄奈米科技相關活動、參考文獻及研究單位、相關網站的連結,提供產學界一個方便的知識交流窗口。網站主持人為蔡雅芝教授。

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停工即停薪:如何證明你的時間值多少?車禍背後的認知 x 情緒 x 金錢 x 法律大混戰
鳥苷三磷酸 (PanSci Promo)_96
・2026/01/09 ・3351字 ・閱讀時間約 6 分鐘

本文與 PAMO車禍線上律師 合作,泛科學企劃執行

走在台灣的街頭,你是否發現馬路變得越來越「急躁」?滿街穿梭的外送員、分秒必爭的多元計程車,為了拚單量與獎金,每個人都在跟時間賽跑 。與此同時,拜經濟發展所賜,路上的豪車也變多了 。

這場關於速度與金錢的博弈,讓車禍不再只是一場意外,更是一場複雜的經濟算計。PAMO 車禍線上律師施尚宏律師在接受《思想實驗室 video podcast》訪談時指出,我們正處於一個交通生態的轉折點,當「把車當生財工具」的職業駕駛,撞上了「將車視為珍貴資產」的豪車車主,傳統的理賠邏輯往往會失靈 。

在「停工即停薪」(有跑才有錢,沒跑就沒收入)的零工經濟時代,如果運氣不好遇上車禍,我們該如何證明自己的時間價值?又該如何在保險無法覆蓋的灰色地帶中全身而退?

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如果運氣不好遇上車禍,我們該如何證明自己的時間價值?/ 圖片來源: Nano Banana

薪資證明的難題:零工經濟者的「隱形損失」

過去處理車禍理賠,邏輯相對單純:拿出公司的薪資單或扣繳憑單,計算這幾個月的平均薪資,就能算出因傷停工的「薪資損失」。

但在零工經濟時代,這套邏輯卡關了!施尚宏律師指出,許多外送員、自由接案者或是工地打工者,他們的收入往往是領現金,或者分散在多個不同的 App 平台中 。更麻煩的是,零工經濟的特性是「高度變動」,上個月可能拚了 7 萬,這個月休息可能只有 0 元,導致「平均收入」難以定義 。

這時候,律師的角色就不只是法條的背誦者,更像是一名「翻譯」。

施律師解釋「PAMO車禍線上律師的工作是把外送員口中零散的『跑單損失』,轉譯成法官或保險公司聽得懂的法律語言。」 這包括將不同平台(如 Uber、台灣大車隊)的流水帳整合,或是找出過往的接單紀錄來證明當事人的「勞動能力」。即使當下沒有收入(例如學生開學期間),只要能證明過往的接單能力與紀錄,在談判桌上就有籌碼要求合理的「勞動力減損賠償 」。

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PAMO車禍線上律師的工作是把外送員口中零散的『跑單損失』,轉譯成法官或保險公司聽得懂的法律語言 / 圖片來源: Nano Banana

300 萬張罰單背後的僥倖:你的直覺,正在害死你

根據警政署統計,台灣交通違規的第一名常年是「違規停車」,一年可以開出約 300 萬張罰單 。這龐大的數字背後,藏著兩個台灣駕駛人最容易誤判的「直覺陷阱」。

陷阱 A:我在紅線違停,人還在車上,沒撞到也要負責? 許多人認為:「我人就在車上,車子也沒動,甚至是熄火狀態。結果一台機車為了閃避我,自己操作不當摔倒了,這關我什麼事?」

施律師警告,這是一個致命的陷阱。「人在車上」或「車子沒動」在法律上並不是免死金牌 。法律看重的是「因果關係」。只要你的違停行為阻礙了視線或壓縮了車道,導致後方車輛必須閃避而發生事故,你就可能必須背負民事賠償責任,甚至揹上「過失傷害」的刑責 。 

數據會說話: 台灣每年約有 700 件車禍是直接因違規停車導致的 。這 300 萬張罰單背後的僥倖心態,其巨大的代價可能是人命。

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陷阱 B:變換車道沒擦撞,對方自己嚇到摔車也算我的? 另一個常年霸榜的肇事原因是「變換車道不當」 。如果你切換車道時,後方騎士因為嚇到而摔車,但你感覺車身「沒震動、沒碰撞」,能不能直接開走?

答案是:絕對不行。

施律師強調,車禍不以「碰撞」為前提 。只要你的駕駛行為與對方的事故有因果關係,你若直接離開現場,在法律上就構成了「肇事逃逸」。這是一條公訴罪,後果遠比你想像的嚴重。正確的做法永遠是:停下來報警,釐清責任,並保留行車記錄器自保 。

正確的做法永遠是:停下來報警,釐清責任,並保留行車記錄器自保 。/ 圖片來源: Nano Banana

保險不夠賠?豪車時代的「超額算計」

另一個現代駕駛的惡夢,是撞到豪車。這不僅是因為修車費貴,更因為衍生出的「代步費用」驚人。

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施律師舉例,過去撞到車,只要把車修好就沒事。但現在如果撞到一台 BMW 320,車主可能會主張修車的 8 天期間,他需要租一台同等級的 BMW 320 來代步 。以一天租金 4000 元計算,光是代步費就多了 3 萬多塊 。這時候,一般人會發現「全險」竟然不夠用。為什麼?

因為保險公司承擔的是「合理的賠償責任」,他們有內部的數據庫,只願意賠償一般行情的修車費或代步費 。但對方車主可能不這麼想,為了拿到這筆額外的錢,對方可能會採取「以刑逼民」的策略:提告過失傷害,利用刑事訴訟的壓力(背上前科的恐懼),迫使你自掏腰包補足保險公司不願賠償的差額 。

這就是為什麼在全險之外,駕駛人仍需要懂得談判策略,或考慮尋求律師協助,在保險公司與對方的漫天喊價之間,找到一個停損點 。

談判桌的最佳姿態:「溫柔而堅定」最有效?

除了有單據的財損,車禍中最難談判的往往是「精神慰撫金」。施律師直言,這在法律上沒有公式,甚至有點像「開獎」,高度依賴法官的自由心證 。

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雖然保險公司內部有一套簡單的算法(例如醫療費用的 2 到 5 倍),但到了法院,法官會考量雙方的社會地位、傷勢嚴重程度 。在缺乏標準公式的情況下,正確的「態度」能幫您起到加分效果。

施律師建議,在談判桌上最好的姿態是「溫柔而堅定」。有些人會試圖「扮窮」或「裝兇」,這通常會有反效果。特別是面對看過無數案件的保險理賠員,裝兇只會讓對方心裡想著:「進了法院我保證你一毛都拿不到,準備看你笑話」。

相反地,如果你能客氣地溝通,但手中握有完整的接單紀錄、醫療單據,清楚知道自己的底線與權益,這種「堅定」反而能讓談判對手買單,甚至在證明不足的情況下(如外送員的開學期間收入),更願意採信你的主張 。

車禍不只是一場意外,它是認知、情緒、金錢與法律邏輯的總和 。

在這個交通環境日益複雜的時代,無論你是為了生計奔波的職業駕駛,還是天天上路的通勤族,光靠保險或許已經不夠。大部分的車禍其實都是小案子,可能只是賠償 2000 元的輕微擦撞,或是責任不明的糾紛。為了這點錢,要花幾萬塊請律師打官司絕對「不划算」。但當事人往往會因為資訊落差,恐懼於「會不會被告肇逃?」、「會不會留案底?」、「賠償多少才合理?」而整夜睡不著覺 。

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PAMO看準了這個「焦慮商機」, 推出了一種顛覆傳統的解決方案——「年費 1200 元的訂閱制法律服務 」。

這就像是「法律界的 Netflix」或「汽車強制險」的概念。PAMO 的核心邏輯不是「代打」,而是「賦能」。不同於傳統律師收費高昂,PAMO 提倡的是「大腦武裝」,當車禍發生時,線上律師團提供策略,教你怎麼做筆錄、怎麼蒐證、怎麼判斷對方開價合不合理等。

施律師表示,他們的目標是讓客戶在面對不確定的風險時,背後有個軍師,能安心地睡個好覺 。平時保留好收入證明、發生事故時懂得不亂說話、與各方談判時掌握對應策略 。

平時保留好收入證明、發生事故時懂得不亂說話、與各方談判時掌握對應策略 。 / 圖片來源: Nano Banana

從違停的陷阱到訂閱制的解方,我們正處於交通與法律的轉型期。未來,挑戰將更加嚴峻。

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當 AI 與自駕車(Level 4/5)真正上路,一旦發生事故,責任主體將從「駕駛人」轉向「車廠」或「演算法系統」 。屆時,誰該負責?怎麼舉證?

但在那天來臨之前,面對馬路上的豪車、零工騎士與法律陷阱,你選擇相信運氣,還是相信策略? 先「武裝好自己的大腦」,或許才是現代駕駛人最明智的保險。

PAMO車禍線上律師官網:https://pse.is/8juv6k 

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進軍太空產業!SpaceX 啟航,台灣太空中心佈局低軌衛星供應鏈——當商用電子產品從地面上太空,必經哪些環境測試?
宜特科技_96
・2024/12/02 ・4779字 ・閱讀時間約 9 分鐘

低軌衛星引爆全球商機,全球太空經濟在 2040 年預計突破 1 兆美元,許多國家跟科技大廠都加速投入太空市場,台灣也成立太空國家隊。但面對火箭與太空環境嚴苛的考驗,如何在地面模擬測試,使產品能在軌道順利運行?

本文轉載自宜特小學堂〈從地面到太空 商用衛星電子零組件必經的測試〉,如果您對半導體產業新知有興趣,歡迎按下右邊的追蹤,就不會錯過宜特科技的最新文章!

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自從 1957 年第一顆人造衛星發射後,現今已有近萬顆衛星在太空飛行,並且數量持續增加中。衛星已經跟我們的日常生活密不可分,例如地圖導航、實況轉播等,另外.俄烏戰爭中使用「星鏈」衛星通訊連網,台灣也在今年四月的花蓮地震首次使用低軌衛星技術,協助災區通訊。因此,發展衛星科技除了民生用途,也深具國家安全考量。

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台灣從 2019 年到 2029 年,於第 3 期「國家太空科技發展長程計畫」投入超過新台幣 400 億元,進行低軌通訊衛星的研製、規劃國家發射場與人才培育。工研院估算,至 2030 年全球每年將發射 1,700 顆衛星升空,屆時將創造至少 4,000 億美元的產值。根據美國衛星產業協(Satellite Industry Association)預計,全球太空經濟在 2040 年更有望突破 1 兆美元,其中衛星產業占比上看 88%,達 9,252 億美元。

衛星按軌道高度可分成低軌(LEO<2,000 Km)、中軌(MEO<10,000 Km)以及地球同步軌道衛星(GEO~35,800 Km),重量從幾公斤到數百公斤不等,其中 SpaceX Starlink 低軌通訊衛星近年轉商業化,開啟了新太空經濟模式。另外立方衛星(CubeSat)造價門檻相對低,成為切入衛星技術研究的熱門標的。衛星產業鏈日趨成熟,以及衛星發射和製造成本的降低,帶來龐大的太空商機,相應的電子零組件需求亦隨之增加,讓不少廠商對邁向太空市場摩拳擦掌。

衛星依據軌道高度的分類。圖/宜特科技

衛星是由幾個次系統整合而成,包含姿態控制、電力、熱控、通訊、推進和酬載(Payload)…等。例如遙測衛星(Remote Sensing Satellite),它的功能是繞地球軌道拍攝照片,其中姿態控制次系統使鏡頭能維持對著地球方向;影像感測器則是攝取影像的酬載,電力次系統負責電力儲存與電源管理,最後將照片透過通訊次系統傳回地面。

衛星內部有我們熟知的各種電子零組件,正統太空規的電子零組件要價不斐,且某些零件因各國管制政策不易取得,而商用現貨(Commercial Off-the-Shelf,簡稱 COTS),例如電腦、手機和汽車採用的電子零組件,價格親民、性能良好,供貨也較充沛,近年採用 COTS 執行太空任務是相當熱門的趨勢。

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衛星的次系統。圖/宜特科技

那麼,COTS 電子零組件要上太空,必須經過哪些驗證測試?本文將從火箭發射環境、太空環境,逐一說明 COTS 欲跨入太空應用將面臨的挑戰和驗證測試方式。

3.2.1 發射!火箭發射對電子零組件的影響

1. 振動測試

衛星在地面製造組裝,需考量溫度、濕度、粉塵汙染等影響;組裝好的衛星搭乘火箭從地面發射,首先會承受火箭的劇烈振動,振動測試機可以在地面模擬火箭發射,以垂直與水平方向進行振動測試。不同的火箭有不同的振動大小,例如美國 SpaceX 獵鷹重型火箭的振動測試參數,以每秒鐘 10~2,000 次的振動頻率,重力加速度到幾十倍,振動測試可用來確認衛星或電子零組件在經歷發射過程仍能正常運作。

美國 SpaceX 獵鷹重型火箭發射。圖/p.7, SPACE X FALCON USER’s GUIDE, August 2021

立方衛星振動測試。圖/Sat Search

2. 音震測試

火箭發射過程會產生音震(Acoustic Noise),尤其是面積大且薄的零件,特別容易受音震影響,例如太陽能電池板,天線面板等。音震可能會使這些零件破裂、機構損壞、功能異常。音震艙就是用來模擬火箭所產生的音震,測試時將液態氮汽化,此時液態氮體積會瞬間膨脹數百倍產生巨大壓力,再經由喇叭將氣流動能轉為聲波導入音震艙,測試音震艙內的衛星或零件。

音震艙測試。圖/European Space Agency

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3. 衝擊測試

當火箭離開地面抵達一定的高度時,各節火箭引擎開始陸續分離,接著整流罩展開釋放衛星入軌,這些過程都會產生衝擊(Shock),對衛星內部零件的焊接點、晶片,或其他脆性材料都是嚴苛的考驗。因此需要在地面先進行衝擊測試,了解衛星與其電子零組件對巨大衝擊的耐受程度。

火箭整流罩打開釋放衛星。圖/German Aerospace Center 

衝擊測試。圖/金頓

4. 電磁相容性測試

此外,因為各種電子零組件集中在火箭狹小空間內,衛星跟火箭之間的電磁干擾可能會影響任務,因此衛星在發射前也需經過電磁相容性測試(EMC),確保衛星所使用的電子零組件不會與火箭之間互相干擾。

電磁相容性測試。圖/ European Space Agency

  1. 熱真空循環測試

低軌衛星以每秒七公里的時速飛行,大約九十分鐘繞行地球一圈,衛星繞軌飛行處於真空環境,同時也會面臨溫差挑戰,當衛星被太陽正面照射時,其溫度高達攝氏 120 度,遠離太陽時,溫度可能低到零下 120 度。另外,真空環境可能使電子零組件因散熱不良燒毀,真空低壓也會造成零組件材料分解、腔體洩漏(Leak),或是零組件釋氣(Outgassing)產生汙染。

熱真空循環測試(Thermal Vacuum Cycling Test)可模擬太空環境真空狀態與溫度變化,測試時會將衛星或電子零組件架設於極低壓力的真空艙內,再經設備以輻射、傳導方式對衛星或電子零組件升降溫以模擬太陽照射,此時衛星或電子零組件處於通電運作狀態,須即時監控觀察其功能是否正常。熱真空循環通常測試為期一週甚至更長,也是衛星或電子零組件常見的失效項目。

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熱真空艙測試。圖/TriasRnD

  1. 輻射測試

少了大氣層的保護,電子零組件在太空環境會直接面對輻射的衝擊。以地球軌道而言,輻射環境包含輻射帶(Van Allen Belts)、銀河宇宙射線(Galactic Cosmic Rays,簡稱GCR)以及太陽高能粒子(Solar Energetic Particles,簡稱SEP),這些輻射環境充斥大量的電子、質子,以及少數的重離子(Heavy Ion)等,若擊中衛星的電子零組件可能造成資料錯亂(Upset)、當機,甚至永久性故障。衛星在軌道運行壽命短則幾個月,長則數十年,衛星在軌道運行時間越長,受輻射衝擊影響就越大。

地球軌道輻射環境。圖/宜特科技

輻射對電子零組件的影響有以下三大類:

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太空輻射對電子零組件的三大效應。圖/ESA

  1. 總電離劑量效應(Total Ionizing Dose Effect,簡稱TID)

電子零組件在太空環境長期累積大量質子與電子輻射是 TID 效應的主因, TID 會造成 MOS 電晶體 Threshold Voltage 緩慢飄移,零件漏電因此逐漸增加,漏電嚴重時則會導致零件燒毀。衛星可視為大型的無線行動裝置,依賴太陽能蓄電,電力相當珍貴,若衛星內諸多的電子零件都在漏電,將造成衛星電力不足而失聯或失控。

  1. 位移損傷效應(Displacement Damage,簡稱DD)

質子對電子零組件會產生另一種非輻射效應,稱為位移損傷效應(DD),屬長期累積大量質子的物理性損傷,質子會將半導體零件內的矽原子打出晶格外,形成半導體的缺陷,零件漏電也會逐漸增加,其中光電零件對 DD 效應較敏感,例如影像感測元件,DD 會造成影像品質降低,另外也會使衛星使用的太陽能電池(Solar Cell)轉換效率下降。

  1. 單一事件效應(Single Event Effect,簡稱SEE) 

TID 與 DD 可以看成慢性病,是電子零組件長期在軌累積大量質子與電子作用所造成的漏電效應,SEE 就是屬於急性症狀,隨機發生又難以預測。質子與重離子都會造成電子零組件的 SEE 效應,而重離子比質子更容易引發 SEE,太空環境的重離子數量雖然相對少,但殺傷力強,一顆重離子就可能使電子零組件當機或損壞。

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SEE 造成的故障可分成 Soft ERROR 與 Hard Error 兩大類。 Soft Error 的徵狀為資料錯亂、當機、功能異常等,重啟電路可恢復其運作,但若電子零組件對輻射很敏感,當機頻率過高則會影響任務執行,因此需以輻射測試評估其事件率(Event Rate)。Hard Error 則是永久性故障,例如重離子容易引發半導體零件栓鎖(Latch-Up)現象,若沒有對應機制,零件可能因大電流燒毀,因此 SEL (Single Event Latch-Up)是太空電子零件輻射耐受度最重要的指標之一。

單一事件效應的各種現象。圖/宜特科技

太空環境有各種能量的粒子,包含:質子、電子、重離子…,能量越高的粒子可穿透越厚的物質或外殼。低能量的粒子可被衛星外殼(鋁)阻擋,但衛星發射成本主要以重量計價,外殼厚度相當有限(通常為幾毫米厚的鋁材);而高能量的粒子則會穿透衛星外殼,影響電子零組件運作,因故使用於太空環境的電子零組件必定會被輻射影響,在上太空前必須經過輻射測試評估其特性。COTS 電子零組件,都有一定的抗輻射能力,但是必須經測試了解輻射耐受度是否適用於太空任務需求。

美國 NASA 的太空輻射實驗室。圖/NASA

COTS 電子零組件上太空前必須經過「發射環境測試」,包括模擬火箭發射時所產生的振動、音震、衝擊、電磁相容性測試,以及太空環境熱真空循環和輻射測試等,更多的測試項目就不一一細數,通過這些測試後,更重要的是取得「飛行履歷」(Flight Heritage),將產品發射上太空,若能成功執行各種任務,取得越多飛行履歷,產品的身價就越高,太空產業非常重視飛行履歷,飛行履歷也是產品的最佳保證書!

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宜特是亞洲最完整的太空環境測試第三方實驗室, 2019 年與國研院太空中心合作推動台灣太空產業發展。自 2021 年加入台灣太空輻射環境驗測聯盟以來,我們已完成多種電子零組件的輻射測試,涵蓋了類比、數位、記憶體、射頻等。我們將持續建構更完整的太空環境驗證測試能量,提供一站式服務。協助廠商可專注於產品的設計與製造。

本文出自 www.istgroup.com

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宜特科技_96
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我們了解你想要的不只是服務,而是一個更好的自己:) iST宜特自1994年起,以專業獨家技術,為電子產業的上中下游客戶, 提供故障分析、可靠度實驗、材料分析和訊號測試之第三方公正實驗室

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DNA-PAINT:轉瞬標記 奈米解析
顯微觀點_96
・2024/10/03 ・3586字 ・閱讀時間約 7 分鐘

本文轉載自顯微觀點

圖/顯微觀點

DNA-PAINT:易脫落的奈米「漆」

DNA-PAINT 屬於單分子定位顯微術(SMLM)大家族一員,它突破繞射極限的途徑類似 PALM 與 STORM:以閃爍(blinking)的螢光讓多個目標分子的位置輪番呈現,最後將多次定位影像以電腦疊合重建成完整的超解析分子地圖。結合電腦運算輔助和光學成像的統計原理,DNA-PAINT 可以達成極端細緻的 RESI 定位術,清楚區別兩個距離不到 1 奈米的螢光來源。

單看字面,DNA-PAINT 給人「以 DNA 作為油漆」的印象。事實稍有不同,這種技術以 DNA 作為「點累積奈米成像術」(PAINT , Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography)的探針。接上螢光染劑的短小 DNA 片段,可以靈敏標記蛋白質、染色體以及許多細胞內構造。

DNA-PAINT 的特別之處,在於利用「不牢固」的螢光標記製造閃爍效果。不同於 PALM, STORM 以光調控「固著在目標上」的螢光來源,DNA-PAINT 使用與目標連結力量薄弱的螢光探針,結合目標之後會快速分離。只有在探針與目標結合的瞬間,同時被激發光照射,探針上的螢光團才能發出螢光。目標分子與螢光探針分離後,依然保有和下一個探針結合的能力,因此不必擔心螢光團的放光能力衰退。

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Dna Barcoded Labeling Probes For Highly Multiplexed Exchange Paint Imaging
DNA-PAINT 原理:Docking strand(嵌合序列)附著在人造 DNA 構造上,溶液中漂浮著成像序列(Imager strand),成像序列上的螢光團不容易被激發(膚色)。成像序列與嵌合序列結合時,螢光團才會被激發(橘紅色) 圖片來源:Agasti, Sarit S., et al. Chemical science 8.4 (2017): 3080-3091.

DNA-PAINT 使用的 DNA 探針片段長度不超過 10 個鹼基,又稱寡核苷酸(oligonucleotides 或oligomers)。這些短小 DNA 片段可以附加上螢光染劑的螢光團分子,成為螢光探針。

DNA 探針的結合對象是另一段互補的 DNA 片段,此互補序列會預先透過抗體與定位目標連結,等待 DNA 探針前來結合。DNA 探針因為具有螢光團,被稱為「成像片段(imager strand)」,而牢固於目標的互補序列則稱為「嵌合片段(docking strand)」。對生物細胞進行 DNA-PAINT 時,嵌合片段與目標分子之間常有抗體或配體做為銜接,需要類似免疫螢光染色的前置作業,目標表面的抗原也可以因應實驗需求進行設計。

因為兩個短小 DNA 片段之間的結合力有限,成像片段與嵌合片段結合後會快速分離。而螢光團只有在結合目標時才容易放光,因此可以形成閃爍的螢光定位標記。經由電腦疊合閃爍的定位影像,DNA-PAINT 可以達成 10 奈米左右的超解析定位,若沒有序列成像的幫助,依然無法突破奈米以下解析度的光學障礙。

Direct Visualization Of Single Nuclear Pore Complex Proteins Using Genetically‐encoded Probes For Dna‐paint
以 DNA-PAINT 對細胞核膜上的 Nup96 核孔蛋白進行 3D 定位。在圖 a. 中,不同的螢光色彩象徵不同的空間深度。圖 b. 箭頭所指處,則是成對出現的 Nup96 蛋白。比例尺:圖 a. 2000nm, 圖 b. 50 nm. 圖片來源:Schlichthaerle, Thomas, et al. Angewandte Chemie 131.37 (2019): 13138-13142.

核孔複合體(Nuclear Pore Complex)上的 Nup96 蛋白是科學家經常探索的重要目標,即使是超解析顯微術也未能在自然狀態下呈現其構造。隆曼團隊以 RESI 對 Nup96 進行定位,不但清楚定位出符合電子顯微鏡拍攝的 8 對 Nup96 蛋白沿著核孔形成環狀結構,還能清楚呈現每對蛋白之間的 11 奈米的間距。

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結合序列成像(Sequential Imaging)與 DNA-PAINT 兩種技術,RESI 讓科學家得以運用一般門檻的顯微儀器、耗材,就能達到超乎以往想像的定位解析度。而 DNA-PAINT 這種巧妙的定位方法並非一蹴而就,而是數種有趣的技術累積而成。

PAINT 起源:不穩定又不專一的尼羅紅

PAINT(Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography, 點累積奈米成像術)系列定位法的螢光探針由一個螢光染劑分子與一個分子探針(probe)構成。親和性抗體、寡核苷酸(短小 DNA 片段)都可作為分子探針的材料,再由此探針結合目標分子或其上的抗體。除了 DNA-PAINT, PAINT 家譜上還有 FRET-PAINT, Exchange-PAINT, u-PAINT 等不同特質的成員。

在 2006 年由沙羅諾夫(A. Sharonov)和霍克崔瑟(R. M. Hochstraser)發表的第一代 PAINT 中,僅僅使用螢光染料尼羅紅(Nile Red)為標記。這種染劑在含水溶劑中無法發光,必須進入磷脂層等非極性環境才能展現其螢光活性。

因此尼羅紅無須結合探針,只要以低濃度加入樣本溶液中,就能觀察到其進入細胞膜脂雙層、大型磷脂囊泡(large unilamella vesicles)表層等疏水性環境中,受到激發放出螢光。尼羅紅與磷脂層的親和性不強,很快就會再次脫離,也容易遭到光漂白(photobleaching)而失去螢光,因此可作為一種閃爍的螢光定位標記。

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尼羅紅可以結合所有疏水性(hydrophobic)的構造,無法真的標記特定分子,缺乏分子生物學重視的專一性。但它開啟了 PAINT 以「不牢固螢光染劑」增進解析度的先河。與多數螢光顯微術追求螢光團穩定性與強度的定位技巧背道而馳。

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圖 a. 以尼羅紅標記磷脂層的直接成像;圖 b. 以 PAINT 技術進行上千次成像重建後的磷脂層定位。兩者定位解析度形成強烈對比。圖 c. 為 uPAINT 概念:接受激發光(綠色)照耀的螢光探針才會發光(紅色),漂浮在激發光範圍外的螢光探針保持黯淡(粉紅),即使未結合目標的探針也能發光,且僅能標記細胞膜表面的目標。圖片來源:Nieves, Daniel J., et al. Genes 9.12 (2018): 621.

4 年後,吉安諾內(G. Giannone)和荷西(E. Hosy)以具目標專一性的配體,例如抗體蛋白,連接螢光團形成螢光探針,達成具有專一性的 PAINT 超解析定位。透過進步的生化技術製作配體,這種技術幾乎可以定位所有類型的目標,因此被命名 universal-PAINT, 簡稱 uPAINT。

uPAINT 可以提升多種目標的定位解析度,但其螢光探針即使游離在溶液中,也能接受激發、放出螢光,形成背景雜訊。且結合螢光染劑的抗體無法穿透細胞膜,因此只能定位細胞膜上的目標。

因此 uPAINT 必須限縮激發光照射的範圍,對準目標、減少雜訊,例如微調全內反射顯微鏡(TIRF)的角度,形成「高傾斜層光照明」(Highly Inclined and Laminated Optical sheet, HILO)以限定激發範圍。

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同在 2010 年,隆曼與史坦豪爾(C. Steinhauer)嘗試以寡核苷酸為探針,定位 DNA 摺紙構造(DNA origami structure)上的目標,達到了奈米等級的解析度。DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography 正式誕生,善用「不牢固的螢光探針」與電腦運算的輔助,以一般螢光顯微鏡就能突破繞射極限。

無限調色的虛擬油漆:Exchange-PAINT

2014 年,隆曼與同事阿凡達尼歐(M. S. Avendaño)、沃爾斯坦(J. B. Woehrstein)發表 DNA-PAINT 的巧妙變化,除了同時以不同探針標記不同構造,達成精準的多重定位(multiplexed localization),更實現以一種螢光超解析定位多種目標,讓多重標記的潛力加速實現。

這種多重標記被隆曼與同事稱為 Exchange-PAINT,同樣使用 DNA 片段作為探針。在同一個樣本的 10 種不同目標上,連結了 10 種不同的嵌合片段(docking strands),隆曼等人再以 10 種互不干涉的短小 DNA 序列(orthogonal sequences)作為成像片段(imager strands)。

他們每次只加入一種成像片段,針對一種目標進行閃爍(blinking)定位,並由電腦套上特定顏色,接著洗去既有成像片段,再加入下一種成像片段。最後將所有目標的獨立定位圖疊合起來,便能得到完整的奈米級定位。

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Multiplexed 3d Cellular Super Resolution Imaging With Dna Paint And Exchange Paint 2
圖 a.為 Exchange-PAINT 概念,每一輪定位針對一種目標,完成後洗去探針,再加入下一種探針進行定位,最後將每一輪的定位影像疊合起來。圖 c., 圖 d. 表現 Exchange-PAINT 的多工能力, 1 個 DNA 摺紙樣本上的 10 種不同目標可以依序定位,賦予顏色(實際上使用相同螢光染劑,不同成像片段),再以電腦重建疊合。每一種目標的定位都進行了 7500 次拍攝。圖 d., 圖 e. 中的比例尺為 25nm. 圖片來源:Jungmann, Ralf, et al.  Nature methods 11.3 (2014): 313-318.

只需要一種螢光染劑接上多種成像片段,Exchange-PAINT 便能以基本的實驗設備達到多重目標的超解析定位,不像多重標記的 DNA-PAINT 受限於染劑顏色數目,Exchange-PAINT 的門檻在於互不相干寡核甘酸片段的數目,在實驗中幾乎不可能窮盡。而可以使用一般螢光顯微鏡與螢光染劑達到埃(ångström)解析度的 RESI 技術,就是將 Exchange-PAINT 的多種目標定位應用於單種目標定位,透過不同探針標記同種目標製造發光順序落差,大幅提升解析度。

在「眼見為真」的生物學影像趨勢中,「增加偵測光子數量」是螢光顯微技術提升解析度的基礎光學原理,也是最主流的技術改良方向。而 DNA-PAINT 系列技術跳脫了對光子數量的追求,不受螢光染劑的光漂白及螢光壽命限制,以快速脫落的探針另闢蹊徑,使低成本的超解析影像得以實現,更展現生物物理學蘊藏的廣泛技術可能性。

參考資料:

  • DNA-PAINT 的最新應用:RESI序列成像解析度增強術
  • Jungmann, Ralf, et al.  Nature methods 11.3 (2014): 313-318.
  • Agasti, Sarit S., et al.  Chemical science 8.4 (2017): 3080-3091.
  • Nieves, Daniel J., Katharina Gaus, and Matthew AB Baker. Genes 9.12 (2018): 621.
  • Schlichthaerle, Thomas, et al.  Angewandte Chemie 131.37 (2019): 13138-13142.
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顯微觀點_96
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