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用吹泡泡搭設三維細胞鷹架,讓細胞脫離培養皿的「平面國」

研之有物│中央研究院_96
・2018/07/31 ・3242字 ・閱讀時間約 6 分鐘 ・SR值 540 ・八年級
  • 採訪編輯|歐柏昇 美術編輯|張語辰

物理學家做細胞研究?

中研院物理所的林耿慧副研究員,帶領團隊發明製作「細胞鷹架」,可在三維環境中培養細胞,比二維平面的培養皿更接近生理環境。不僅能藉此了解細胞的物理,也可應用在組織工程、精準醫療等方面。

物理學家研究細胞?你也許心想,這篇文章是不是「錯頻」了?其實沒有,林耿慧就是研究細胞的物理學家。

林耿慧在美國念書的時候,有一個潮流鼓勵物理科學家 (physical scientist) 轉到生物學 (biology) 研究。她研究的「軟物質」領域與生物物理也算接近,生物物理中用了許多軟物質的方法。於是,林耿慧回國後就投入了生物物理的研究。圖/張語辰

不同於培養皿 全新細胞鷹架創造三維實驗空間

林耿慧說,大部分的細胞必須貼附在基材上才能存活。一般培養細胞的「基材」就是培養皿,但是培養皿是二維的平面,如果想要養出三維的結構,培養皿做不到。然而,身體內的細胞,都有三維的結構。

真實細胞生長於三維環境,與二維平面(如培養皿)的條件不同。圖/林耿慧

很早以前就有人想到,可以製造一個三維的「鷹架」來培養細胞。許多組織工程學研究試著製作細胞鷹架,不過一直未能培養出一個有完好功能的組織或器官。

林耿慧認為,要成為一個完好的組織,端視細胞與基材、還有細胞與細胞之間作用力協調出來的結構;但因為現今製作細胞鷹架的方式很不均勻,導致鷹架孔洞大小不一,因此很難了解細胞如何與鷹架作用。林耿慧想到了統計力學的這個概念:就算給定一模一樣的能量、溫度條件,還是會有很多的微觀狀態 (microstate);那不如創造出很多一模一樣的微環境,去觀察裡面細胞的狀態。「我的想法就是讓全部微環境都一樣,就可以觀察很多東西。」

「吹泡泡」技術 低成本細胞鷹架夢想成真

細胞鷹架該怎麼作呢?有些科學家提出 3D 列印的方法,可惜很難印出夠小的孔洞。那為什麼要做夠小的孔洞呢?

細胞怎麼感覺自己在三維?它沒眼睛,一定是靠觸摸的。

林耿慧說,我們如果沒有眼睛,也會覺得自己在二維,除非空間的尺度跟自己本身的尺度差不多,可以觸摸到環境,才能夠感覺自己在三維。細胞的尺度大約是 10 到 100 微米大小,因此如果做出類似大小的孔洞,就可以讓細胞生長在三維的環境。

林耿慧的專長,正好是製作小塑膠球,博士論文就是做「膠體粒子」,把幾百奈米到幾百微米的小球堆疊成晶體。她想,這是她的老朋友,現在只要把尺度改成 10 微米以上就可以了。

查了文獻,林耿慧發覺她的想法已經被別人發明了。但是,讀完文獻之後,發覺前人的做法並不好,製作過程又慢又貴,自己仍然大有可為。

那個時候,「微流道」剛好發展起來,林耿慧對其研究現況有持續掌握。她看到一個方法,是用微流道吹泡泡,尺度剛好和細胞鷹架所需一模一樣,「就是我要的方法!」於是,林耿慧開始在實驗室製作這樣的泡泡。

利用微流道,可以做出大小一樣的泡泡。收集起來,把它背景變成膠,再把孔洞相連通,最後就可以拿來裝細胞。

實驗中通入氣體和液體,利用微流道「吹泡泡」製作細胞鷹架,動態如下圖所示。圖/林耿慧

林耿慧用微流道來吹泡泡製作細胞鷹架,實驗相當成功。不但成本很低,製作所需時間也很短,做一個不到一分鐘。並依此申請了專利,也成功技轉,現在這個產品可以在生化試劑最大販賣平台的 Sigma-Aldrich 上買到。

進化的三維環境 讓實驗與真實更接近

三維的細胞鷹架,有什麼功用呢?不但可以應用於再生醫學、人工敷料,也對精準醫療有所幫助。林耿慧表示,現在化學製藥成本不算太貴了,最貴的是篩藥,而用三維細胞培養來篩藥,應該會有更接近身體內細胞的反應。

一般篩藥是在二維平面進行。在二維平面上篩出有效的藥,最後去做動物實驗常常卻沒有效,原因可能是二維比較不接近生理環境。

林耿慧舉例,1992 年生物學家米納‧碧賽爾 (Mina Bissell) 的團隊,把乳癌細胞養在二維和三維環境來做實驗。他們放了一些抗體進去,發現在三維環境,這些惡性腫瘤細胞可以回復成良性,但在二維環境卻維持惡性。如此一來,傳統在二維的篩藥方法就篩不出來這個藥效。

另外,即使是表皮細胞,乍看之下是平坦的二維結構,但事實上,經常要形成管狀構造才有功能。例如血管、氣管,都需要管狀的細胞。而在二維平面上養細胞,很難養出管狀結構。

三維細胞培養一大瓶頸在於成本。一般三維培養用的材料如水膠,價格昂貴、操作時間又慢,而林耿慧發明的細胞鷹架,突破了這些限制;又經由技轉公司的進一步改良後,操作上和二維培養一樣方便了。

二維培養皿、三維細胞鷹架培養的細胞影像。紅色部分是肌動蛋白 (F-actin),綠色部分是沾黏的纖維組織 (Paxillins)。在二維環境中,細胞呈現平行發展;在三維環境中,細胞長成立體結構。圖/林耿慧

物理學家眼中的細胞力學

製作出細胞鷹架只是第一步。林耿慧利用這樣的鷹架來培養細胞,做了各方面的細胞研究。她用物理方法,來量化細胞的體積、曲率,這是與一般生物學不同之處。

我的研究風格就是量測,然後去量化。那些東西未必是生物學家會去量的。

林耿慧說,生物學家量化的東西不一樣,例如他們會去量化蛋白質的表現。物理學家則是量化細胞的物理,例如「看到彎彎的線,就去量化曲率半徑」,因為這與細胞的作用力、能量有關。

量測細胞的形態,其實很困難。我們無法拿尺量測細胞,需要憑藉影像,而光是處理影像就很麻煩。林耿慧團隊突破這些技術困難,獲得一些有趣的發現,找到了一些在二維和三維不同的細胞型態:例如黏著斑尺寸比較小的細胞,其應力纖維也比較細,而黏著斑與應力纖維的分布是環繞整個細胞身體,呈現三維分布。而還有一些尚未發表的結果,皆顯示細胞在三維與二維的不同,團隊後續希望能從細胞力學的角度來解釋這些差異。

要研究生物物理,跨科重新學「常識」

生物物理包含許多跨領域專業,林耿慧團隊實驗成果的背後,其實是艱辛的歷程。

林耿慧笑說:帶領跨領域的實驗室比較累,有時學生來實驗室前沒有足夠的背景「常識」,更不用說非常少學生來實驗室前,就有足夠的背景「知識」。圖/張語辰

林耿慧說明,因為沒有現成的「生物物理」學系,可以教給學生所需的背景「常識」,所以學生來實驗室都需要從頭學起。有些學生學得快,有些學生會在一些不同領域中應該是常識的細節上出錯,例如:之前曾帶過機械系的學生,不知道將化學樣品加入溶液後要充分混合才能使用。在團隊裡,擅長養細胞的學生不一定會寫程式,而擅長寫程式的學生不一定會養細胞,因此研究經常要拆開來做。

此外,團隊與生物學家合作,也是不斷磨合的過程。林耿慧談到,物理學和生物學研究的方法學不同:物理學家很多研究是基於觀察的研究,並且習慣「套用理論」來解釋事情;而生物學家的研究方法主要是以「假說檢驗」。偶爾,跨領域合作中,由於彼此不夠了解對方的領域,有時會高估彼此的能力。雖然並非易事,但林耿慧團隊仍持續和生物學家合作,得到了豐碩的研究成果。

從軟物質起家,林耿慧跨入生物的範疇,以物理的方法研究細胞。就像《平面國》一書所傳播的三維福音:「向上,而非向北」,透過細胞鷹架開啟三維的視角,也得以對生命的最小單位有更多探索的空間。

本著作由研之有物製作,原文為《培養細胞的新技術──「吹泡泡」製作細胞鷹架》以創用CC 姓名標示–非商業性–禁止改作 4.0 國際 授權條款釋出。

本文轉載自中央研究院研之有物,泛科學為宣傳推廣執行單位

 

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看鳥巢七十二變!從鳥類親緣關係看鳥巢如何演化
研之有物│中央研究院_96
・2021/01/22 ・3498字 ・閱讀時間約 7 分鐘 ・SR值 511 ・六年級

本文轉載自中央研究院研之有物,泛科學為宣傳推廣執行單位。

  • 採訪撰文/張容瑱
  • 美術設計/林洵安

鳥巢在鳥類演化佔有關鍵地位

如果把全世界的鳥巢放在一起看,會發現什麼有趣的模式呢?中研院生物多樣性研究中心洪志銘副研究員、端木茂甯助研究員與臺灣師範大學生命科學系碩士生方怡婷,統整全世界五千多種鳥巢,推算鳥巢的演化史,發現鳥巢與鳥類的演化歷程息息相關,研究成果刊登在《自然通訊》(Nature Communications),跟著研之有物一起來了解。

鳥巢,鳥類演化求生的關鍵

打從幼稚園開始就是動物「控」的洪志銘,笑說自己「一直長不大」,對動物的喜愛都沒有「進化」。他兒時的志願不是動物園的動物管理員,就是獸醫,年紀漸長才知道,要在野外近距離接觸動物,應該從事生物研究。

正式踏上生物研究後,洪志銘選擇以鳥類為主題,從基因的角度探討鳥類如何適應環境、怎樣演化。他花了大把心力研究鳥類繁殖最重要的工具——鳥巢,因為鳥巢是鳥類延續下去的關鍵之一。洪志銘認為,現在地球的氣候愈來愈極端,鳥類更需要保護蛋和幼雛,鳥巢益發不可或缺。

鳥類築巢行為是否能迅速應付環境的改變,將是決定其繁盛或滅絕的關鍵。

「但研究鳥巢演化的人其實很少,」洪志銘解釋:「一般研究鳥巢通常只選擇幾種鳥種來看,我們是用整個鳥類親緣關係樹來做研究,才能全面地了解鳥巢的演化。」

鳥巢七十二變,怎麼看門道?

但鳥巢種類千變萬化,要從哪裡著手?鳥類築巢是非常複雜的行為,先要選擇適當的位置、收集材料,再堆疊或編織成巢。從巢位、巢材,到築巢的方法、巢的外型結構等等,變化很大,可說是有多少種鳥,就有多少種鳥巢!

最後,洪志銘的團隊選擇了鳥巢的外型結構、所在位置、附著方式三個特徵,分析它們如何隨著時間逐漸變化。

「這三個特徵的資料是最齊全的,也容易分類,」洪志銘解釋:「比方說,巢材雖然也很重要,但變化太大,同一種鳥在臺灣用某種草築巢,在菲律賓用的是另一種草,很難歸類,也不容易有完整的資料。」

研究人員查閱《世界鳥類圖鑑》(the Handbook of Birds of the World Alive,HBW)線上版,統整全世界 242 科 5000 多個鳥巢描述;獲取各科鳥類巢的特徵之後,再利用電腦程式,沿著已知鳥類親緣關係樹,回推追溯各科的鳥祖先築的巢是什麼樣子,慢慢建構出鳥巢的演化史。

巢型,來自基因的呼喚

第一個特徵是巢型,主要可分為:無結構、平臺狀、杯碗狀、球狀、球狀加隧道,以及樹洞或土洞等洞巢。

無結構巢是最簡單的巢型,不具有建築構造,鳥直接把蛋下在地面、峭壁或樹枝上,或是用身體、腳在地面刮擦、蹭出一個淺坑,再下蛋於其中。杯碗狀的巢是大家最熟悉的巢型,白頭翁、綠繡眼、家燕的鳥巢,中南部的赤腰燕則是球狀巢附帶長長的隧道。洞巢又可分為兩種,自己挖洞築巢的,例如啄木鳥、五色鳥、翠鳥的巢,屬於「初級洞巢」,像貓頭鷹、鴛鴦、犀鳥等等,使用天然樹洞或其他動物挖鑿的洞穴,稱為「次級洞巢」。

圖中為織巢鳥用嘴喙銜著並編織自己的懸吊式球狀鳥巢,鳥巢開口向下。全世界大多數鳥類都會築巢,鳥巢巢型主要可分為:無結構、平臺狀、杯碗狀、球狀、球狀加隧道,以及樹洞或土洞等洞巢。
圖│iStock

結果發現,巢型的演化大致上是從簡單到複雜:先是沒有結構的無結構巢,發展出堆疊巢材的平臺狀巢,之後是利用天然的洞穴、自己鑿洞,然後是球狀和杯碗狀巢。但也有例外,比如現在最常見的杯碗狀巢,在鳥類演化較早期就曾在特定類群出現過。

再者,鳥的親緣關係愈近,築的巢型愈相似,表示巢的外型結構主要由與生俱來的基因決定。「如果在野外撿到鳥巢,從外型結構大致可以準確判斷是哪類鳥的傑作。」洪志銘說明。

巢位、附著方式,容易受外在影響

再來是巢位 (所在位置),鳥類選擇築巢的位置非常多樣,包括:地上、樹上、非喬木植物、峭壁、河岸等等。鳥類的共同祖先起初是地上孵蛋育雛,接著到樹上築巢,這也是最常見的巢位,大約三分之二的鳥類把巢築在樹上。不過洪志銘分析資料顯示,巢位的變化與基因、親緣關係較不相關,比較容易受到捕食壓力、種間或種內的競爭等外在環境因素影響。

岩燕在岩壁上築起葫蘆狀的泥巢,天敵不容易捕食幼鳥。鳥類選擇築巢的位置,根據捕食壓力、種間或種內競爭可分為地上、樹上、非喬木植物、峭壁、河岸等等。
圖│iStock

最後是鳥巢的附著方式,分成底部支撐、水平分叉固定、側掛和垂吊四種,底部支撐是最常見的,也是最早演化出來的。研究也發現,在本次分析的三種鳥巢特徵中,附著方式與鳥類的親緣關係最不相關。

圖中白頭翁和紅鳩的鳥巢為底部支撐、綠繡眼的鳥巢為水平分叉固定。鳥巢的附著方式,主要分成底部支撐、水平分叉固定、側掛和垂吊四種,以底部支撐最常見。
圖│研之有物

值得注意的是,雖然外型結構、所在位置和附著方式的演化並不同步,卻會相互影響。舉例來說,平臺狀巢或洞巢發展出來之後,鳥類才離開地面,開始在水面或河岸等新的地點築巢;杯碗狀巢或球狀巢出現之後,巢位才擴展到草叢、藤蔓等非喬木植物;杯碗狀巢、球狀巢則和側掛、垂吊等「非底部支撐」的附著方式有著緊密的演化關聯性……構成千變萬化的鳥巢。

輻射適應事件,造就當今鳥類多樣性

這次研究也發現,鳥巢的演化與兩次鳥類輻射適應事件相關。洪志銘解釋說,鳥類輻射適應有兩次,第一次大約在六千五百萬年前,也就是 K-Pg 界線,恐龍滅絕後,鳥類在很短的時間內擴展出很多類群,從僅存的單一個類群「今鳥類」分化出鴕鳥、雞、鴨、啄木鳥等各種鳥類。第二次輻射適應大約在三千萬至四千萬年前,麻雀、燕子、白頭翁、綠繡眼、八哥等雀形目的鳥大量分化出來。現今,雀形目大約占了所有鳥類的百分之六十。

這兩次輻射適應事件,造就了現今地球擁有上萬種的鳥類。洪志銘比喻說:「就像你跑到一座居民撤離後的城市,房子都空了,你愛住哪兒,就住哪兒。」K-Pg 界線時,恐龍和許多鳥類類群都滅絕了,地球上空出很多生存的空間,也就是所謂的「生態區位」,今鳥類便分化出各式各樣的體型、大小、嘴喙等,以占領不同的區位。

至於第二次鳥類輻射適應的發生,目前還不確定原因,洪志銘認為可能與植物多樣性增加有關,因為高高低低、形形色色的植物出現,環境層次變多,生態區位也變多了,促使雀形目大量分化。

第一次鳥類輻射適應,分化出非雀形目的不同類群,搶占恐龍滅絕後空出來的生態區位。第二次鳥類輻射適應,則是雀形目鳥類大量分化出不同類群。

以鳥巢的外型結構來看,巢型的大量變化與第一次輻射適應的時間點相符:巢型原本只有無結構巢,大約在第一次輻射適應時,出現了平臺狀巢、杯碗狀巢和洞巢等不同結構的巢型。

第二次輻射適應事件主要是演化出雀形目的鳥類,可以構築結構更為複雜的巢,並發展不同的附著方式,進而利用新的築巢位置,附著方式和巢位這兩個特徵的多樣化也與第二次輻射適應事件相符。

圖│研之有物

本次研究雖然是在電腦上作業,洪志銘也花很多時間在實驗室做基因研究,但回到生物學家的初衷,他最愛的還是野外近距離觀察生物。

「做生物研究,還是要回到生物本身。基因的變化會在生物身上變化,如果看到基因有意義的變化,很可能是適應環境的結果。」洪志銘的研究團隊還會在鳥類適應環境的過程中,發掘出什麼有趣的模式呢?一起拭目以待!

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灑下百道層光,一窺微觀世界的生命律動:「晶格層光顯微鏡」如何為細胞拍攝寫真集
研之有物│中央研究院_96
・2018/08/29 ・4927字 ・閱讀時間約 10 分鐘 ・SR值 579 ・九年級

  • 採訪編輯|廖英凱 美術編輯|張語辰

為活細胞拍微影像

中研院應用科學研究中心的陳壁彰助研究員,與團隊利用「空間光調變器」開發了「晶格層光顯微鏡」,具有高解析度、長時間觀測、低光毒性的特性,改革了活體螢光顯微術,使研究者能親眼目睹例如細胞分裂等活體生命現象。

陳壁彰團隊成員,與晶格層光顯微鏡。攝影/廖英凱

那些年,科學家如何「小」看世界

十七世紀起,Robert Hooke 與 Antoni van Leeuwenhoek 提出了顯微鏡的技術發展與改進,成為了微觀尺度生物學的關鍵基礎。隨著顯微鏡的改良與倍率的提升,我們也越來越了解微觀世界的樣貌。一沙一世界的美麗境界,就隨著一片片精心磨製的玻璃鏡片,向科學家敞開了偉大的航道。

然而,到了十九世紀後期,科學家開始察覺到:顯微鏡似乎無法隨著技術的進展,而使倍率不斷地放大。

圖/pixabay

Ernst Abbe 發現,這是由於光的波動性造成的干涉與繞射,導致顯微鏡所能得到的最小解析度,僅能是二分之一個用來觀測的光的波長。例如,如果利用波長是 500 奈米的黃光來觀測,所能得到的解析度就僅能有 250 奈米,雖還能看到細胞與細菌,但卻無法看清楚細胞內各胞器的樣貌。這一個波長的限制,也就是所謂的「繞射極限」。

為了突破繞射極限的阻礙,各種截然不同的思維與原理,催生了不依靠「可見光」來觀測微觀世界的顯微術,包含:利用觀測「電子」來顯示物體內結構、或表面樣貌的電子顯微鏡;利用原子間「凡得瓦力」的作用,來呈現物質表面樣貌的原子力探針顯微鏡;或利用近場光學的方式,將光源與樣品接近到只有數十個奈米,使距離拉遠時,光學的干涉與繞射現象無法顯現出來。

但多數相關觀測技術,都需在相當限制的條件,例如真空環境、極薄的樣品切片等才得以進行,對於活體生物的觀察仍受到諸多限制。

直至近二十年來,各種「螢光顯微術」的發展,使觀測微觀活體生物世界,有了嶄新的研究方式。

由於生物細胞的胞器或生物分子等,並不盡然有顯著的顏色差異,因此不能單純僅依靠可見光與倍率放大來觀察;因此,螢光顯微術的核心原理是將外加的「螢光分子」,附著或接合在指定的生物分子上,如特定的蛋白質或特定的脂質等。由於這些特定的生物分子的分布,會與生物細胞內的結構有關,所以藉由觀察螢光的分布,我們就能了解生物細胞的微觀結構。

2014 年,由 Eric BetzigStefan W. Hell 和 William Esco Moerner 等人榮獲的諾貝爾化學獎,其重要性就是利用了螢光分子的化學特性,繞過了物理上繞射極限的阻礙,而達到超高解析度的生物影像。

如何看得小又快、久又深

但是,儘管有超高解析度的影像,並不盡然能表現出活體生物裡的動態樣貌。現有螢光技術中,常利用汞燈與雷射來激發螢光分子,但這些激發的能量,往往使螢光能顯現的時間非常短,激發光的能量也會對生物分子造成傷害,也就是所謂的「光毒性」。

然而,若能夠延長觀測的時間與增加激發能量,則又可以觀測到活體生物的動態表現、與更細緻的現象;此外,多數超高解析度的顯微技術,都侷限在空間解析度的強化,而無法看到活體生物的立體結構與變化。

這些面向導致螢光顯微術的發展,總是在這四個維度之中拉鋸取捨:看得小(空間解析度)、看得快(時間解析度)、看得久(光毒性)與看得深(影像深度)。

光子預算 (photon budget) 的四個維度。活體生物影像總是在看得小、看得快、看得久與看得深,這四個維度中拉鋸取捨。資料來源/陳壁彰提供、圖說重製/廖英凱、張語辰。

為了實踐活體生物分子的螢光顯微觀測,中研院陳壁彰助研究員師承 Eric Betzig ,與團隊研發出「晶格層光顯微術」,讓光源只精準地照射到生物樣品中所要觀察的焦平面上,這樣的照明方式,可以減少不必要的照明以減少光毒性,又因只照明到待觀測的切面上,而能有效減少背景雜光。

如下圖,傳統的螢光顯微術中,照明的光源是與觀測視角同向的寬場光源 (widefield),使得觀測樣本整體都接受到激發光的能量,所要觀測的焦平面上下範圍,也因會被光源照射到,而產生背景雜光影響觀測品質。

為了解決寬場光源這樣過度照明的缺點,另一種「共軛焦顯微術」是利用針孔 (pin-hole),讓焦平面上的光源僅聚焦在極小的區域,但極小的焦平面上下的區域,仍然會被光照到而產生雜光。

螢光顯微術的這兩種照明方式,樣品的背景區域皆會被光照到,而產生雜光。
資料來源│陳壁彰提供 圖說重製│廖英凱、張語辰

如下圖,另一種傳統平面層光照明的方式,則是將照明的方向與物鏡觀測的方向垂直(正交),使被照明的區域可以籠罩待觀測的焦平面,但這樣的照明區塊仍然太厚。

對於以上的問題,利用「貝索層光照明」的方式,可以有效地改善。因為貝索光束能在焦平面上形成一條寬度僅有 0.5 ????m 的光束,使照明的光源僅照射到待觀察的焦平面上,讓影像擁有極佳的光學切面效果;再利用與光束垂直的觀測物鏡,以寬場成像的方式收集螢光。因此,只要在樣本中移動貝索光束,就能逐條觀測出待測樣品的微觀樣貌。

傳統平面層光照明,雖試著將光線聚焦於焦平面,然而其減少雜光的效果,還是不若貝索層光照明好。
資料來源│陳壁彰提供 圖說重製│廖英凱、張語辰

貝索層光照明動態示意:從X軸方向,利用單一貝索層光(藍線)掃描樣品(灰色塊),獲得切面(白色塊)。
資料來源│陳壁彰提供 圖說重製│廖英凱、張語辰

貝索層光照明動態示意:透過上下移動樣品,就能觀察到到不同深度的樣品切面。
資料來源│陳壁彰提供 圖說重製│廖英凱

用液晶螢幕圖形,製造出數百條層光

但是對於活體生物來說,僅依賴一條貝索層光掃描,仍無法精準且即時地觀測到生物體內的動態現象。因此,陳壁彰團隊應用了「構造化照明顯微術」(Structured Illumination Microscopy, SIM)的思維,先利用一個二維的光學晶格,來侷限光的延展方向,而輸出一層光;再利用自行開發的「空間光調變器」(Spatial Light Modulator, SLM),控制晶格紋路的呈現圖形。

陳壁彰團隊利用「空間光調變器」,可操控液晶螢幕上的圖形,讓雷射光穿過、製造出數百條貝索層光。
攝影│廖英凱 圖說重製│張語辰

空間光調變器,是一個由程式控制的液晶螢幕,螢幕上顯示了由理論計算出來的相位圖案,當入射的雷射光打到這個螢幕上的圖案時,如同透過一個光柵,使雷射光產生繞射、生成數百條的層光。利用數百條貝索層光同時掃描樣品時,僅需要「抖動」一下樣品,就能完成一次完整的掃瞄。

此外,由於可利用程式控制液晶螢幕上的相位圖案,因此研究者不會像傳統光學實驗一般,被所能取得的光柵元件特性侷限,而能精細且多樣化地微調出理想的層光狀況。

比起使用「單一貝索層光」來逐行掃描,陳壁彰團隊的方法不僅能維持良好的空間解析度,更因「數百條貝索層光」能快速完成掃描樣品的特性,而讓觀測結果有良好的時間解析度。再者,也能因精準地使用較低能量的光束,而維持低光毒性,來對活體樣本(例如細胞)進行長時間的追蹤觀測。

利用數百條貝索層光(藍線)掃描樣品(灰色塊)時,僅需要些微「抖動」樣品,就能完成一次完整的切面掃描(白色塊)。
資料來源│陳壁彰提供 圖說重製│廖英凱、張語辰

為活細胞拍微影像

晶格層光顯微鏡「良好時空解析度」與「低光毒性」的特性,可以讓研究者長時間觀測微觀生物世界的動態現象,例如:特別針對追蹤細胞內單分子的動態,來理解生物體內某些反應機制;或如下方影片動態,利用每秒一次的頻率完整掃描細胞,錄製長達十分鐘的影像,從而觀察到細胞分裂的完整流程與細節。

晶格層光顯微鏡的問世,引起眾多生物實驗室的高度興趣,特別是陳壁彰博士後時期的老師 Eric Betzig 非常強調顯微鏡的開發,一定要有生物學的「應用」!

因此,當晶格層光顯微鏡的第一版建置完成後,當時 Eric Betzig 特別要求陳壁彰租車開了 10 多個小時,將顯微鏡整組打包、載到一個研究烏賊神經網路的暑期工作營隊中,將晶格層光顯微鏡介紹給其他研究社群,並陸續在一年內與 37 個不同生物實驗室合作,觀測了各式各樣的生物樣本。除了能快速累積實驗資料以改善顯微鏡,也開啟廣泛接觸到不同研究主題的契機。

左圖為陳壁彰團隊運用晶格層光照射的海拉細胞二維影像,右圖是一般貝索光束。可以見到晶格層光能取得較細緻的結構成像。
資料來源│Chen, B. C., Legant, W. R., Wang, K., Shao, L., Milkie, D. E., Davidson, M. W., … & English, B. P. (2014). Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science, 346(6208), 1257998.

目前,晶格層光顯微鏡已從它眾多的觀測成果,被驗證為觀測活體生物的利器。然而晶格層光顯微鏡在面對深度較深的樣品時,仍會因為樣品本身的像差,而影響成像能力。且生物體中仍有太多不透明物質,會嚴重阻礙活體生物的觀察。

2014 年回到臺灣後,陳壁彰在中研院擁有自己的實驗室,陳壁彰認為,未來的研究方向,除了引進在天文觀測中,用以抵銷大氣影響的自適應光學 (adaptive optics) 概念以外,也須開發出對應的樣品製備方式,例如利用化學方法將脂質替換掉,使樣品透明化以便於顯微觀測。

相較於多數生物學界慣行的研究方法,「活體生物顯微術」的概念仍相當新穎,其中對於活體的定義、樣品的製備方式、與之對應的研究方法設計,都尚有研發與推廣的空間。但無庸置疑的是,晶格層光顯微鏡的問世,已為觀測微觀世界的生命律動,灑下了百道一窺堂奧的洞察之光。

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本著作由研之有物製作,原文為《灑下百道層光,一窺微觀世界的生命律動──晶格層光顯微鏡》以創用CC 姓名標示–非商業性–禁止改作 4.0 國際 授權條款釋出。

 

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推理要在實驗室:為什麼有些細菌會致病、有些不會呢?
研之有物│中央研究院_96
・2017/10/17 ・4507字 ・閱讀時間約 9 分鐘 ・SR值 503 ・六年級

細菌的身世之謎

為什麼有些細菌會致病、有些不會?為什麼有些細菌需要依賴宿主存活、有些不用?要回答這些問題,需要比較不同的細菌,找出其中基因的異同處,就如同推理劇般一步步推敲細菌們的演化史。

「世界上有很多細菌,我們的工作是研究這些細菌如何變得不一樣!」中研院植物暨微生物所的郭志鴻副研究員說,圖/by 張語辰。

為什麼研究細菌?

細菌的多樣性非常高,因為演化的歷史比動植物長很多,可以生存的環境也很多樣。

目前證據顯示細菌在三十億年前就在地球上出現,而多細胞生物的演化史則不到十億年。另外動植物能生存的範圍蠻窄的,但無論在高溫、低溫、高壓、低壓、低氧……什麼奇怪的環境都能找到細菌,所以能探討的題目就很多。

我從博士後訓練時期開始投入「細菌基因體演化」的研究。一開始先問巨觀的問題,例如說有什麼演化趨勢是在大部份的細菌都會發現。 2010 年起在中研院建立自己的實驗室,興趣也轉向針對微觀的細節深入研究。近年來主要的研究材料是柔膜菌綱中的「植物菌質體」和「螺旋菌質體」。

細菌演化有何奇妙現象?

在演化的歷程中,細菌擁有的基因「種類」和「數量」會有劇烈的變化。

橫軸可以解釋為細菌演化的歷程,也可以解釋為細菌有多需要宿主。資料來源:Winding paths to simplicity: genome evolution in facultative insect symbionts,圖重製/by 林婷嫻、張語辰。

若以基因體大小和宿主依賴度來分,細菌可分為「環境微生物」、「兼性共生菌」、「絕對共生菌」。

在細菌演化的歷程中,一開始的環境微生物基因體較大,帶有各式各樣在自然環境中生存所需的基因。但經過「第一次過渡事件」後,就從完全不依靠宿主,變成兼性共生菌,在有些條件下和宿主一起存活。

當需要依靠特定的動植物時,細菌的族群就不能比宿主大,一但細菌的族群變小,「天擇」的力量就會減弱,由隨機事件掌控的「遺傳漂移 (genetic drift) 」就變得比較重要。許多突變,即使對細菌本身不利,都有機會因為隨機事件遺傳給下一代,甚至到族群中所有個體。

族群大,天擇重要;族群小,遺傳漂移重要。

細菌基因體的突變,最常見的形式是「基因丟失」,這些被丟失的基因不是絕對必要、比較像「備用工具」,若失去這些備用工具平時不會產生大影響,這個結果就容易遺傳給下一代。

到了「第二次過渡事件」,細菌從兼性共生變成絕對共生,不能再離開宿主,例如柔膜菌綱的「植物菌質體」。這時候因為很多營養可以改成從宿主身上取得,許多自行合成氨基酸、脂質等養份的基因就像不再被需要的備用工具,也自然從細菌的基因體中消失。也因此這些細菌可能走入演化的死巷,難以再轉換到其他的生態棲位。

細菌三十億年前出現在地球上,這些基因演化發生地多快多慢,目前並不清楚,因為細菌不像恐龍有化石紀錄,很難定年。

實驗室在研究哪些細菌?

我們實驗室主要研究柔膜菌綱中的細菌。這類細菌最廣為人知的是「黴漿菌」,引起很多人類跟動物的重要疾病,世界上有很多實驗室在研究。而我們則主要研究「植物菌質體」和「螺旋菌質體」,並比較這三群細菌間的異同。

柔膜菌綱包含三種:「黴漿菌」會讓溫體動物生病;「植物菌質體」會讓植物生病;而大部分的「螺旋菌質體」是節肢動物的共生菌,有的會致病、有的不會致病。資料來源:郭志鴻,圖重製/by 林婷嫻、張語辰。

植物菌質體是一群由昆蟲傳播的植物病菌,幾十年來都無法被人工培養。我們透過基因體定序,由受感染的植物中分別解出「植物」和「植物菌質體」的 DNA 序列 ,並將「健康的植物」和「被感染的植物」做比較分析,來了解植物菌質體如何讓植物生病,這對農業非常重要。

左為健康的繡球花,右為受植物菌質體感染、該開花的部位長出葉子。圖/from Genomic and evolutionary aspects of phytoplasmas

植物菌質體進入植物體內後,會分泌小小蛋白質、調控植物細胞裡基因的表現,讓該開花的部位長出很多葉子。

植物菌質體可以將植物「開花」的機制切換成「長更多葉子」的機制,如此一來植物無法傳宗接代,在演化上等於死掉一樣。而且因為植物無法開花結果,對農業生產造成很大的問題。

除此之外,植物菌質體還會降低植物用來防禦昆蟲的化學物質、吸引昆蟲來吃植物,這麼一來植物菌質體又能藉由昆蟲散播到新的宿主。我們正在研究植物菌質體是利用什麼機制來調控這過程。

相對於「植物菌質體」都會讓植物宿主生病,同屬於柔膜菌綱的「螺旋菌質體」,大部分是節肢動物的共生菌,有的會讓宿主生病、有的不會。

這是螺旋菌質體好玩的地方,我們能從「比較基因體學」的角度,去看螺旋菌質體這個屬內的「病菌」和「非病菌」物種的基因哪裡不同,是多了或少了某個基因造成這種差別;也能探討這些演化是如何發生,是藉由「垂直基因遺傳」、或是「水平基因轉移」。

螺旋菌質體在光學顯微鏡下,看起來像被稍微拉長的捲捲電話線。資料來源:Chemotaxis without Conventional Two-Component System, Based on Cell Polarity and Aerobic Conditions in Helicity-Switching Swimming of Spiroplasma eriocheiris,圖重製/by 林婷嫻、張語辰。

為什麼有些細菌會致病、有些不會?

和三斑家蚊共生的螺旋菌質體 S. diminutum ,可以和蚊科宿主和平共處。但另一種和三斑家蚊共生的螺旋菌質體 S. taiwanense ,會破壞蚊科宿主的組織、增加死亡率。資料來源:Comparison of Metabolic Capacities and Inference of Gene Content Evolution in Mosquito-Associated Spiroplasma diminutum and S. taiwanense,圖重製/by 羅文穗、張天昫、林婷嫻、張語辰、郭志鴻。

我們這幾年研究蚊子身上的螺旋菌質體,結果發現有致病性的 S. taiwanense 能夠消化的「碳水化合物」較少,但因為帶有一組非病菌所沒有的 glpO 基因,能在蚊子體內改吃甘油、並生成「過氧化氫」等「活性氧物種」,造成蚊科宿主的細胞溶掉、釋放出細胞裡的蛋白質和脂質, S. taiwanense 就能吃這些蛋白質和脂質作為養分來源,相當具有侵略性。

S. taiwanense 這樣苦苦相逼宿主有什麼好處?它採取的策略是,只要我傷害宿主可以多複製幾個細胞,提高傳播到下個宿主的機會,就是有利的生存策略。反過來說,若宿主是獨居性的動物,一座山頭只有一隻,共生菌就會傾向與宿主和平共存,因為若傷害宿主、細菌也無法存活。

共生菌要多具有侵略性,受限於宿主的「族群密度」和「傳播機會」。

會做這個題目是因為,我們透過文獻知道 S. taiwanense 和 S. diminutum 這兩種螺旋菌質體都是蚊子的共生菌,但 S. taiwanense 會使蚊子生病, S. diminutum 卻不會。我們選了一些與 S. taiwanense 、 S. diminutum 親緣關係相近的菌種,比較這些菌種的演化史,看看是哪個基因造成這種差別。除了多瞭解台灣本土的昆蟲共生菌之外,也許有機會發展於登革熱的生物防治。

細菌會水平轉移基因?

以前課本教:基因是爸媽遺傳給我們,因此一般會認為生物演化大多是「垂直基因遺傳」,再慢慢累積突變,造成物種間的差異。而「水平基因轉移」的意思是,一個物種可以從其他物種得到自己原本所沒有的新基因,這是細菌演化上很重要的機制。

細菌是體細胞兼生殖細胞,所以很容易「水平轉移」基因。

如下圖,我們分析細菌的親緣關係,發現剛剛提到的 glpO 基因是從別的菌種「水平轉移」拿來的。這些新拿來的基因不只存在於細菌基因體中裡,還會被納入基因調控的分子機制中、產生新的反應。

(A)圖:若基因演化史為「垂直遺傳」,則親緣關係會像此圖。演化關係相近的物種,例如上方五個以紅色標示的螺旋菌質物種,在親緣樹上也會較接近。
(B)圖:來自 S. taiwanense 的基因 (STAIW_v1c07530))跟其他的螺旋菌質體物種的基因(紅色)關係較遠,反而跟黴漿菌的基因(藍色)關係較近,推測可能是因為此基因是 S. taiwanense 自黴漿菌水平轉移而得到。資料來源:Molecular Evolution of the Substrate Utilization Strategies and Putative Virulence Factors in Mosquito-Associated Spiroplasma Species

「超級細菌」是怎麼回事?

目前人類了解的細菌不到整體百分之一,而新科技的發展讓我們開始慢慢了解許多過去沒研究過的細菌。有在實驗室被成功培養出來的細菌中、會讓人類生病的是少數中的少數。

大約一百年前,抗生素剛被發現就像「魔法子彈」,可以治療幾乎所有細菌感染的疾病,但後來抗生素開始失去效果,因為細菌經由基因突變、或藉由水平基因轉移,可以抵抗抗生素。「超級細菌」是因為具備多重抗藥性,已經湊齊能抵抗不同抗生素的基因,除非醫學又開發出新型的抗生素,否則醫生就無藥可用。這過程就像人類和病菌間持續的軍備競賽。

帶有這個抗藥性的基因對細菌有利,這是人類造成的天擇。

天擇造成的生存壓力很大,本來只有某種細菌有某個特定的抗藥性基因,但不同的細菌之間容易互相藉由「水平轉移」傳播抵抗不同抗生素的基因。在疾病管理上,盡量不要讓不同病人帶有的病菌有機會互相接觸。

若要避免產生超級細菌,唯一有效的方法是不要用抗生素。因為在有抗生素的環境中,細菌帶有抗藥性的基因是有利的;但若在沒有抗生素的環境下,細菌帶有抗藥性的基因就變得多餘。

實際上,不要用抗生素真的很難,若非得要用,就要用得徹底,醫生開給你七天的藥就要吃完,讓足夠的藥劑量將病菌在發展出抗藥性前徹底殺死。

如何找到實驗靈感?

沒有公式可以依循,失敗的題目遠比成功的多。

我們從文獻上知道有哪些細菌存在、知道前人做了什麼、有哪些可以做還沒做、有不有趣。做完這些評估,我們再來想想實驗室能不能做到,覺得有希望就試試看。

失敗的話怎麼辦?就偷偷傷心一下下再努力(笑)。例如說賣雞排,倒掉的店也比賺大錢的多,這點可能各行各樣都差不多。

走學術研究這條路,從研究所開始就是不斷面對失敗的訓練。當上老師後不但要分擔學生的挫折,還要為了研究計畫的申請跟成果的發表奮鬥。雖然不斷面對失敗免不了難過,但回頭看過程中學到的經驗,怎麼把困難的問題理出頭緒,找到自己的看法,最後能有幾個有趣的故事可以說出來跟大家分享,這就是做研究迷人的地方。

延伸閱讀

  1. 郭志鴻的個人網頁
  2. 〈蚊科昆蟲共生菌的致病基因演化〉,作者:羅文穗、郭志鴻
  3. Wen-Sui Lo, Ya-Yi Huang, Chih-Horng Kuo* (2016) Winding paths to simplicity: genome evolution in facultative insect symbionts. FEMS Microbiology Reviews, 40, 855-874.
  4. Lo WS, Gasparich GE, Kuo CH* (2015) Found and lost: the fates of horizontally acquired genes in arthropod-symbiotic Spiroplasma. Genome Biology and Evolution 7: 2458-2472.
  5. Chang TH, Lo WS, Ku C, Chen LL, Kuo CH* (2014) Molecular evolution of the substrate utilization strategies and putative virulence factors in mosquito-associated Spiroplasma species. Genome Biology and Evolution 6: 500-509.
  6. Lo WS, Ku C, Chen LL, Chang TH, Kuo CH* (2013) Comparison of metabolic capacities and inference of gene content evolution in mosquito-associated Spiroplasma diminutum and S. taiwanense. Genome Biology and Evolution 5: 1512-1523.

CC 4.0

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