在2004年7月30的Physical Review Letters中 European Laboratory for Nonlinear Spectroscopy in Florence and the Italian National Institute for the Physics of Matter的Diederik Wiersma及其同僚提出了一個模型, 他們認為, 雖然大部分的光子在增益介質中以隨機步行(random walk)的方式反彈大約十次則會離開物質, 然而有少數的光子卻可在物質中反彈100-1000次, 他們稱這些光子是”幸運的光子”. 而這些少數的幸運光子在離開物質時則會伴隨著大量相同波長的同調光子. 估計500次的反彈, 一個光子將會被放大成1012個光子. 他們以實驗及電腦模擬來驗證這個模型, 並得到相當契合的結果.
Norfolk State University in Virginia的Mikhail Noginov表示, 沒錯, 這個模型在某些系統上可以解釋隨機雷射的效應. 然而他更希望能有更多的實驗來測試這個模型的適用範圍.
單看字面,DNA-PAINT 給人「以 DNA 作為油漆」的印象。事實稍有不同,這種技術以 DNA 作為「點累積奈米成像術」(PAINT , Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography)的探針。接上螢光染劑的短小 DNA 片段,可以靈敏標記蛋白質、染色體以及許多細胞內構造。
DNA-PAINT 使用的 DNA 探針片段長度不超過 10 個鹼基,又稱寡核苷酸(oligonucleotides 或oligomers)。這些短小 DNA 片段可以附加上螢光染劑的螢光團分子,成為螢光探針。
DNA 探針的結合對象是另一段互補的 DNA 片段,此互補序列會預先透過抗體與定位目標連結,等待 DNA 探針前來結合。DNA 探針因為具有螢光團,被稱為「成像片段(imager strand)」,而牢固於目標的互補序列則稱為「嵌合片段(docking strand)」。對生物細胞進行 DNA-PAINT 時,嵌合片段與目標分子之間常有抗體或配體做為銜接,需要類似免疫螢光染色的前置作業,目標表面的抗原也可以因應實驗需求進行設計。
因為兩個短小 DNA 片段之間的結合力有限,成像片段與嵌合片段結合後會快速分離。而螢光團只有在結合目標時才容易放光,因此可以形成閃爍的螢光定位標記。經由電腦疊合閃爍的定位影像,DNA-PAINT 可以達成 10 奈米左右的超解析定位,若沒有序列成像的幫助,依然無法突破奈米以下解析度的光學障礙。
因此 uPAINT 必須限縮激發光照射的範圍,對準目標、減少雜訊,例如微調全內反射顯微鏡(TIRF)的角度,形成「高傾斜層光照明」(Highly Inclined and Laminated Optical sheet, HILO)以限定激發範圍。
-----廣告,請繼續往下閱讀-----
同在 2010 年,隆曼與史坦豪爾(C. Steinhauer)嘗試以寡核苷酸為探針,定位 DNA 摺紙構造(DNA origami structure)上的目標,達到了奈米等級的解析度。DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography 正式誕生,善用「不牢固的螢光探針」與電腦運算的輔助,以一般螢光顯微鏡就能突破繞射極限。
無限調色的虛擬油漆:Exchange-PAINT
2014 年,隆曼與同事阿凡達尼歐(M. S. Avendaño)、沃爾斯坦(J. B. Woehrstein)發表 DNA-PAINT 的巧妙變化,除了同時以不同探針標記不同構造,達成精準的多重定位(multiplexed localization),更實現以一種螢光超解析定位多種目標,讓多重標記的潛力加速實現。
這種多重標記被隆曼與同事稱為 Exchange-PAINT,同樣使用 DNA 片段作為探針。在同一個樣本的 10 種不同目標上,連結了 10 種不同的嵌合片段(docking strands),隆曼等人再以 10 種互不干涉的短小 DNA 序列(orthogonal sequences)作為成像片段(imager strands)。