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- 文／曾繁安
科學界的重大考驗：過半實驗無法重現
對科學家來説，要一探隱藏於萬物中的奧秘，無論多麽乏味無趣，把同一件事重複做個好幾遍絕對是家常便飯。研究者在相同條件下可重複自己的結果，稱為可重複性（Repeatability）。而可再現性（Reproducibility），指的是相同的實驗即使交在不同的研究團隊手中，只要根據相同前提、操作步驟一致的情況下，就能夠得出相同的結果。為了獲得可反覆驗證的實驗結果，為後續研究指引正確方向，「可再現性」是學術研究非常重要的基本原則。
但 Nature 一份對超過 1500 名科學家所做的問卷發現，竟有超過 70% 的研究者在試著再現他人的研究時失敗了！即使是自己的實驗，也有過半數的人無法做出相同的結果。
如何在學界激烈競爭及拔得頭籌的時間壓力下，確保實驗結果的可信度，真的很不簡單。目標是將研究成果應用在生物，包括人體上的生醫領域，在實驗的可再現性上更是不可馬虎。但生醫領域，還得面對常用實驗檢測試劑——抗體不穩定性的挑戰！
成也抗體？敗也抗體？
當病菌準備入侵人體時，我們的免疫系統也不是省油的燈，會派出可以識別這些壞家夥的抗體（antibody，又稱免疫球蛋白）來迎戰。抗體是一個 Y 形的蛋白質，其兩個分叉上具有被稱為表位（epitope，又稱抗原結合位）的化學官能基。每一種抗體的表位置可以和一種特定抗原結合，就像一把鑰匙（抗體）只能打開一把鎖（抗原）。抗體靠著表位結構的特異性來辨識外源的抗原並與之結合，阻止病原體繼續感染其他細胞，也有標記之並促發其他免疫反應來進行抵禦的功能。抗體就像人體的警察，發現通緝中的犯人後，趕快逮到拷上手銬限制行動，進一步呼喚其他警力來對抗犯罪行動。
除了在免疫上扮演關鍵角色，抗體因為可以和特定抗原結合的高度特異性，而成為醫學及科研上用來偵測蛋白質表達量的有力工具，可以用於診斷、研究各種疾病的訊號和致病機轉。例如最近中研院所研發的 Covid-19 快篩試劑，便是應用了抗體和特定抗原結合的原理。
抗體的量產，是透過往實驗動物如兔子或羊身上注射抗原產生抗體，對其血液進行分離，從血清中提取而來。儘管抗體是因其高度特異性而被廣泛用於研究，然而跨國科研計劃組織 Human Protein Atlas 針對市面上的抗體產品進行檢測的報告發現，竟有一半的抗體沒有通過品質檢測，存在抗體不穩定性可能導致實驗失敗的疑慮。
實驗結果無法重現，可能是抗體出了錯？這就得談談抗體的交叉反應性（cross-reactivity）。
由於自然界中存在的蛋白質實在多得數不清，抗體的特異性再高，難以保證不會碰到與目標抗原的化學結構非常類似的另一種抗原，因此無法完全排除抗體辨認錯誤發生「開錯鎖」情況的可能性。這種抗體與非標的但相似的抗原結合（off-target binding），就稱作交叉反應性。在疾病診斷上，交叉反應性經常是假陽性結果出現的原因，受試者明明沒有受病毒感染，檢測用抗體卻出現反應。
抗體的交叉反應性，讓實驗結果的可靠性受到威脅，還真是叫科學家傷透了腦筋。抗體又不像實驗室的儀器，可以放包乖乖要它乖乖的，該如何驗證其特異性呢？
HOW TO 驗證實驗結果是可靠的
為了維持實驗數據的品質及一致性，確保研究結果的可靠性，我們必須以更嚴格的方法，對抗體品質進行驗證。由一群蛋白質生物學領域專長之跨國科學家，組成的國際抗體驗證工作小組（International Working Group on Antibody Validation，IWGAC），在 Science Method 上共同發表一篇指導方針，針對如何驗證抗體的特異性、功能性及可重複性，提出了五大可實際應用的强化驗證方法。
IWGAC 團隊認為，如果要宣稱某一種抗體適合投入某項應用，研究者應該至少使用其中一種方法，作為驗證抗體的基準。這五大方法可以為抗體與標的抗原結合提供顯著證據，同時也能評估交叉反應性發生的機率高低，結合兩者去説明抗體的特異性及實驗的可靠性。
以下為强化驗證抗體的五大方法：
- 標記蛋白之表現（Expression of tagged protein）：在標的蛋白進行標記，使其在和抗體結合時會過度表現或呈現螢光，因此可以用來驗證是否和抗體的訊號大小一致。
- 正交驗證（Orthogonal）：利用非抗體的獨立方法對多個樣本進行驗證，例如偵測標的蛋白質體學的內標物，和抗體的訊號進行比較。
- 免疫捕捉法搭配質譜分析（Migration Capture MS Validation ）：
- 獨立抗體（independent antibody） ：利用兩種以上，但與同一個標的蛋白上不同位置表位結合的抗體，來進行對同一個樣品的驗證。
- 基因策略（genetic validation）： 利用含有經由基因剃除或敲落標的基因片段的細胞或組織作為對照組，來驗證抗體的特異性。
其中，基因策略最能直接説明基因、標的蛋白及其抗體偵測的關係，是五大方法中最嚴謹的驗證原則。基因策略採用反證法，為了確認抗體和抗原之間的專一性，會在細胞株中剃除該抗原，再測試觀察抗體的反應。這就像情人間的忠貞程度考驗，如果你的情人在你不在的時候，還跟別人眉來眼去，那他的專一性可能就沒那麼好。
為了創造你（抗原）不在場的情況，會利用基因減弱（gene knockdown）或基因剃除（gene knockout），來降低或去除標的蛋白在細胞中的表現。
基因減弱（gene knockdown）抑制產生特定蛋白質的信使RNA， 來降低標的蛋白的出現機率，但這個狀況就像你躲在旁邊偷看情人的行為，很有可能被情人發現而失敗。而基因剃除（gene knockout）則是比基因減弱的手段來的更為徹底，它直接將表現特定蛋白質的基因片段剪去，也就是你完全離開現場。這個方法則運用了人類從細菌對抗病毒的戰略中，偷師而來的革命性技術—— CRISPR / Cas9。
過去科學家必須耗費大量時間精力，去設計可從 DNA 上截取特定基因片段的酵素，每改變標的基因，就必須重新設計一次複雜的酵素。但從細菌身上找到的 Cas9 酵素，就像一把可客製化的基因神剪，想要剪取某基因片段的話，只要訂做一條與之互補的導引 RNA 交給 Cas9，便能將標的基因片段剪下，再進行基因剃除或插入工作，大大提高過程效率。
CRISPR / Cas9 可以直接從 DNA 剪除會表達標的蛋白的基因片段，使標的蛋白完全失去來到這個世上的機會，名副其實地被 K.O.（擊倒）！如此一來，抗體絕無與基因剃除細胞株反應發生訊號的可能，可說是五大驗證方法內，嚴格中的嚴格。
拿抗體和經過基因剃除的細胞株樣品反應，理應偵測不到任何標的蛋白的表達，因此可以用來確保抗體的專一性（若有訊號，則表示存在抗體交叉反應性！）反之，使用未經處理的原型細胞株進行抗體測試時，則會出現明顯的訊號。
站在科學最前沿的各種實驗，面臨的是許多未知的不確定性。因此研究者如何選擇合適可靠的驗證方法，來節省寶貴的時間與樣本，便是科研工作的一大關鍵。
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