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How to 找到可靠的抗體?做出可信賴的實驗

鳥苷三磷酸 (PanSci Promo)_96
・2021/07/21 ・3312字 ・閱讀時間約 6 分鐘

本特輯由 拜爾國際股份有限公司 委託,泛科學企劃執行

  • 文/曾繁安

科學界的重大考驗:過半實驗無法重現

對科學家來説,要一探隱藏於萬物中的奧秘,無論多麽乏味無趣,把同一件事重複做個好幾遍絕對是家常便飯。研究者在相同條件下可重複自己的結果,稱為可重複性(Repeatability)。而可再現性(Reproducibility),指的是相同的實驗即使交在不同的研究團隊手中,只要根據相同前提、操作步驟一致的情況下,就能夠得出相同的結果。為了獲得可反覆驗證的實驗結果,為後續研究指引正確方向,「可再現性」是學術研究非常重要的基本原則。

Nature 一份對超過 1500 名科學家所做的問卷發現,竟有超過 70% 的研究者在試著再現他人的研究時失敗了!即使是自己的實驗,也有過半數的人無法做出相同的結果。

如何在學界激烈競爭及拔得頭籌的時間壓力下,確保實驗結果的可信度,真的很不簡單。目標是將研究成果應用在生物,包括人體上的生醫領域,在實驗的可再現性上更是不可馬虎。但生醫領域,還得面對常用實驗檢測試劑——抗體不穩定性的挑戰!

成也抗體?敗也抗體?

當病菌準備入侵人體時,我們的免疫系統也不是省油的燈,會派出可以識別這些壞家夥的抗體(antibody,又稱免疫球蛋白)來迎戰。抗體是一個 Y 形的蛋白質,其兩個分叉上具有被稱為表位(epitope,又稱抗原結合位)的化學官能基。每一種抗體的表位置可以和一種特定抗原結合,就像一把鑰匙(抗體)只能打開一把鎖(抗原)。抗體靠著表位結構的特異性來辨識外源的抗原並與之結合,阻止病原體繼續感染其他細胞,也有標記之並促發其他免疫反應來進行抵禦的功能。抗體就像人體的警察,發現通緝中的犯人後,趕快逮到拷上手銬限制行動,進一步呼喚其他警力來對抗犯罪行動。

除了在免疫上扮演關鍵角色,抗體因為可以和特定抗原結合的高度特異性,而成為醫學及科研上用來偵測蛋白質表達量的有力工具,可以用於診斷、研究各種疾病的訊號和致病機轉。例如最近中研院所研發的 Covid-19 快篩試劑,便是應用了抗體和特定抗原結合的原理。

抗體的量產,是透過往實驗動物如兔子或羊身上注射抗原產生抗體,對其血液進行分離,從血清中提取而來。儘管抗體是因其高度特異性而被廣泛用於研究,然而跨國科研計劃組織 Human Protein Atlas 針對市面上的抗體產品進行檢測的報告發現,竟有一半的抗體沒有通過品質檢測,存在抗體不穩定性可能導致實驗失敗的疑慮。

實驗結果無法重現,可能是抗體出了錯?這就得談談抗體的交叉反應性(cross-reactivity)。

由於自然界中存在的蛋白質實在多得數不清,抗體的特異性再高,難以保證不會碰到與目標抗原的化學結構非常類似的另一種抗原,因此無法完全排除抗體辨認錯誤發生「開錯鎖」情況的可能性。這種抗體與非標的但相似的抗原結合(off-target binding),就稱作交叉反應性。在疾病診斷上,交叉反應性經常是假陽性結果出現的原因,受試者明明沒有受病毒感染,檢測用抗體卻出現反應。

抗體的交叉反應性,讓實驗結果的可靠性受到威脅,還真是叫科學家傷透了腦筋。抗體又不像實驗室的儀器,可以放包乖乖要它乖乖的,該如何驗證其特異性呢?

HOW TO 驗證實驗結果是可靠的

為了維持實驗數據的品質及一致性,確保研究結果的可靠性,我們必須以更嚴格的方法,對抗體品質進行驗證。由一群蛋白質生物學領域專長之跨國科學家,組成的國際抗體驗證工作小組(International Working Group on Antibody Validation,IWGAC),在 Science Method 上共同發表一篇指導方針,針對如何驗證抗體的特異性、功能性及可重複性,提出了五大可實際應用的强化驗證方法。

IWGAC 團隊認為,如果要宣稱某一種抗體適合投入某項應用,研究者應該至少使用其中一種方法,作為驗證抗體的基準。這五大方法可以為抗體與標的抗原結合提供顯著證據,同時也能評估交叉反應性發生的機率高低,結合兩者去説明抗體的特異性及實驗的可靠性。

以下為强化驗證抗體的五大方法:

  1. 標記蛋白之表現(Expression of tagged protein):在標的蛋白進行標記,使其在和抗體結合時會過度表現或呈現螢光,因此可以用來驗證是否和抗體的訊號大小一致。
  2. 正交驗證(Orthogonal):利用非抗體的獨立方法對多個樣本進行驗證,例如偵測標的蛋白質體學的內標物,和抗體的訊號進行比較。
  3. 免疫捕捉法搭配質譜分析(Migration Capture MS Validation ):
  4. 獨立抗體(independent antibody) :利用兩種以上,但與同一個標的蛋白上不同位置表位結合的抗體,來進行對同一個樣品的驗證。
  5. 基因策略(genetic validation): 利用含有經由基因剃除或敲落標的基因片段的細胞或組織作為對照組,來驗證抗體的特異性。

其中,基因策略最能直接説明基因、標的蛋白及其抗體偵測的關係,是五大方法中最嚴謹的驗證原則。基因策略採用反證法,為了確認抗體和抗原之間的專一性,會在細胞株中剃除該抗原,再測試觀察抗體的反應。這就像情人間的忠貞程度考驗,如果你的情人在你不在的時候,還跟別人眉來眼去,那他的專一性可能就沒那麼好。

為了創造你(抗原)不在場的情況,會利用基因減弱(gene knockdown)基因剃除(gene knockout),來降低或去除標的蛋白在細胞中的表現。

基因減弱(gene knockdown)抑制產生特定蛋白質的信使RNA, 來降低標的蛋白的出現機率,但這個狀況就像你躲在旁邊偷看情人的行為,很有可能被情人發現而失敗。而基因剃除(gene knockout)則是比基因減弱的手段來的更為徹底,它直接將表現特定蛋白質的基因片段剪去,也就是你完全離開現場。這個方法則運用了人類從細菌對抗病毒的戰略中,偷師而來的革命性技術—— CRISPR / Cas9。

過去科學家必須耗費大量時間精力,去設計可從 DNA 上截取特定基因片段的酵素,每改變標的基因,就必須重新設計一次複雜的酵素。但從細菌身上找到的 Cas9 酵素,就像一把可客製化的基因神剪,想要剪取某基因片段的話,只要訂做一條與之互補的導引 RNA 交給 Cas9,便能將標的基因片段剪下,再進行基因剃除或插入工作,大大提高過程效率。

CRISPR / Cas9 可以直接從 DNA 剪除會表達標的蛋白的基因片段,使標的蛋白完全失去來到這個世上的機會,名副其實地被 K.O.(擊倒)!如此一來,抗體絕無與基因剃除細胞株反應發生訊號的可能,可說是五大驗證方法內,嚴格中的嚴格。

拿抗體和經過基因剃除的細胞株樣品反應,理應偵測不到任何標的蛋白的表達,因此可以用來確保抗體的專一性(若有訊號,則表示存在抗體交叉反應性!)反之,使用未經處理的原型細胞株進行抗體測試時,則會出現明顯的訊號。

站在科學最前沿的各種實驗,面臨的是許多未知的不確定性。因此研究者如何選擇合適可靠的驗證方法,來節省寶貴的時間與樣本,便是科研工作的一大關鍵。

想了解更多基因敲除細胞株的資訊嗎?

立即觀看:https://abclonalbio.com/video/show/84.html

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參考資料

  1. 1,500 scientists lift the lid on reproducibility
  2. 你知道抗體研究一直存在嚴重的「重複危機」嗎?
  3. A proposal for validation of antibodies
  4. Antibody validation
  5. How CRISPR lets us edit our DNA | Jennifer Doudna
  6. 三分鐘了解免疫系統怎麼對抗外來敵軍
  7. 中研院19天破解新冠肺炎抗原檢測,解密四大生技平台!
  8. Enhanced Validation of Antibodies
  9. 人體基因編輯是在編什麼?五分鐘搞懂基因神剪 CRISPR
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誰是COVID-19的重症高風險群?部分需注意干擾素缺陷
寒波_96
・2020/10/17 ・3995字 ・閱讀時間約 8 分鐘 ・SR值 542 ・八年級

今年 1 月起震撼世界的 COVID-19(也稱武漢肺炎、新冠肺炎),一開始在武漢時看似來勢洶洶,非常兇狠。不過現在已經知道,這種疾病對大多數感染者的殺傷力都不是太強,麻煩的是傳播能力強大;假如防疫措施不夠周密,能在不長的時間內感染大量人口,即使重症者的比例不高(即占總人口的比例更低),也將累積不少人數。

為什麼不同人感染病原體 SARS-CoV-2(應該稱為 SARS二世冠狀病毒,但是常被翻譯為新冠病毒)後症狀差異如此明顯?高齡、肥胖、心血管疾病的人重症機率明顯較高,不過多數老人最終仍能康復,卻也有些年輕人相當嚴重。

SARS二世顯然有多種致病方式。最近有兩項研究指出,第一型干擾素(type I interferon)的缺失,也許影響超過 10% 的重症患者。

第一型干擾素。圖/取自 wiki

這兩項研究的領導人都是洛克斐勒大學的 Jean-Laurent Casanova,他是研究遺傳變異與疾病關係的行家 。他主導的其中一篇論文報告:約 3.5% 重症者由於遺傳基因缺失,導致第一型干擾素生產不足。另一篇論文的發現更加驚人:高達 10% 重症者存在自體免疫抗體,會攻擊自己的干擾素。1

干擾素生產線有遺傳缺陷

第一型干擾素有很多款,是一群與免疫相關的細胞激素。有些人出於遺傳因素,製造干擾素先天就不如人。過往研究發現有些製造干擾素有瑕疵的人,感染流感等病毒後,發展為重症的機率也高。SARS二世病毒是否也是如此呢?

這項研究調查 659 位肺炎重症者,其中 13.9% 死亡;他們年紀介於 1 個月到 99 歲,74.5% 是男生,25.5% 女生。製造第一型干擾素的基因是已知的,因此研究者查看相關基因是否有所缺損。其中 113 人在 12 處相關基因位置上,至少有一處看起來可能有問題。2

659 位感染者的年齡、性別、症狀資訊。圖/取自 ref 2

進一步實驗確認,這批可疑目標中至少有 8 個基因,24 處位置的遺傳變異,會讓基因無法正常作用。也就是說 659 位重症者中至少有 23 人,由於遺傳缺失而影響第一型干擾素製造,比例為 3.5%

這 23 人的年齡介於 17 到 77 歲,各種祖源都有,因此第一型干擾素生產不足的問題,似乎不限於特定族群,而是全人類共通。遺傳與武漢肺炎症狀的關係,這是因果關係比較明確的第一個研究。

第一型干擾素生產線與作用上,部分可能有關的基因。圖/取自 ref 2

此一研究以外,最近有其他人以全基因組關聯性分析(GWAS),發現第 3 號染色體上有一段序列,和症狀嚴重的機率有關。而且奇妙的是,那段 DNA 可以追溯到數萬年前智人與尼安德塔人的混血。問題是儘管在統計上見到關聯性,那段 DNA 區域為什麼造成影響,仍毫無頭緒。3

扯後腿的自體免疫抗體

缺乏第一型干擾素,免疫作用受到影響十分合理,而 Jean-Laurent Casanova 主導的另一項研究,還發現干擾素被影響的另一種方式。

抗體是人體接觸入侵者以後,製造出來針對入侵者的武器。有時候抗體卻會攻擊自己的細胞、組織,把自己人當外人打,導致所謂的「自體免疫疾病」。已經知道極少數人的血液中,存在某些 IgG 中和抗體,會攻擊自己的第一型干擾素。

這項研究調查 987 位肺炎重症患者,和 663 位輕微到無症狀的感染者,病情嚴重時的血液樣本,以及疫情爆發前 1227 位健康人士的血液樣本。健康的 1227 人中,4 人具備會攻擊第一型干擾素的抗體,比例為 0.33%;可見沒有感染病毒的時候,已經有很低比例的人具備這類抗體4

抗體娃娃。圖/取自 giantmicrobes

沒大事的都沒有,出大事超過10%有

第一型干擾素有很多款,只要偵測到會攻擊任何一款干擾素的抗體就算數。如此一來,987 位重症者中高達 135 人擁有一種以上抗體,比例為 13.7%;其中至少 101 人的抗體確實能抑制第一型干擾素作用,比例為 10.1%

有些專家懷疑這些針對干擾素的抗體,是因為感染病毒才出現。然而,免疫反應刺激 IgG 抗體生產至少要經過好幾天,從患者血液中偵測到抗體的時間推算,他們應該本來就具備這些抗體,和感染病毒無關。

其他實驗則證實這群人的抗體,不論在體外實驗或真正的人體內,確實有抑制干擾素的效果。最驚人的是 663 位輕微到無症狀者,0 人擁有抗體

歸納如下:

本來就有極低比例的人,擁有會攻擊第一型干擾素的抗體;感染 SARS二世之後沒大事的都沒有抗體,出大事的超過 10% 有抗體。

老人、男生,更危險!

為什麼有些人具備攻擊第一型干擾素的抗體,原因並不清楚;不過觀察指出,和性別、年齡非常有關係。

性別、症狀,和有無扯後腿自體免疫抗體的統計。圖/取自 ref 4

沒有扯後腿抗體的重症者中,男生比例為 75%;有抗體的 101 人中則高達 95 人,比例達到 94%。擁有抗體的人年齡介於 25 到 87 歲,所以從小到老都可能有抗體;但是年紀大的人比例較高,超過 65 歲占 49.5%。

不同人感染 SARS二世的症狀差異很大,此研究提供一點合理的解釋,為什麼老人、男生重症的比例,比年輕人、女生更高。因為擁有攻打第一型干擾素抗體的人,老人、男生的比例,比年輕人、女生更高。不過他們平時沒有差異,都一樣健康,要感染病毒後才有影響。

年齡、症狀,和有無扯後腿自體免疫抗體的統計。圖/取自 ref 4

有些專家感到驚訝,因為女生比較容易出現自體免疫疾病,這兒卻是例外。形成這類抗體的原因,或許和 X染色體的性聯遺傳有關。女生有 2個 X染色體,每個 X染色體都有一半機率被關閉;男生只有 1 個X染色體,只要分配到一定會表現。不過目前這只是猜測,仍然缺乏可靠證據。

第一型干擾素影響超過10%重症

由 Jean-Laurent Casanova 主導的 2 項研究,都發現第一型干擾素缺失,會影響感染 SARS二世病毒後重症的機率。

一項研究發現 3.5% 重症者由於遺傳缺陷,會影響第一型干擾素的製造;另一項研究意外得知 10% 重症者,儘管製造第一型干擾素沒問題,卻擁有扯後腿的抗體。

這兩項研究各自找到第一型干擾素有問題的重症患者們,彼此條件沒有重複,也就是有扯後腿抗體的人沒有遺傳缺陷,遺傳缺陷者沒有抗體。研究的取樣母體不一,不適合直接相加,不過仍然能推論這是影響症狀的一大因素,超過 10% 重症與第一型干擾素有關。考量到重症者總比例很低,這方面影響不可小覷。

Jean-Laurent Casanova 與「一場大瘟疫(Un Grand Fléau)」畫像。圖/取自 洛克斐勒大學

第一型干擾素與 SARS二世病毒的關係值得繼續關注。根據上述發現,衍生出一些有應用價值的推論:

第一,第一型干擾素有缺陷的人,平時多半沒有健康問題,面臨 SARS二世病毒挑戰時才會顯現

第二,沒有會攻打第一型干擾素抗體的人,感染後也可能發展為重症,但是有抗體的絕對是重症的超級高風險群,必需嚴加注意。

第三,康復者血液中擁有對抗 SARS二世病毒的抗體,抽血轉移給另一位病患也許有治療效果。但是假如康復者血液中也有攻擊第一型干擾素的抗體,輸血可能會很危險,必需排除。

第四,干擾素在感染初期是對抗 SARS二世病毒的重要武器,可是有抗體的人,給予第一型干擾素治療很可能無效。不過第一型以外,其他第二型、第三型干擾素也許仍然有用。

第五,由於遺傳缺陷而無法生產第一型干擾素的患者,給予第一型干擾素或許有效

延伸閱讀

參考資料

  1. Hidden immune weakness found in 14% of gravely ill COVID-19 patients
  2. Zhang, Q., Bastard, P., Liu, Z., Le Pen, J., Moncada-Velez, M., Chen, J., … & Rosain, J. (2020). Inborn errors of type I IFN immunity in patients with life-threatening COVID-19. Science.
  3. Zeberg, H., & Paabo, S. (2020). The major genetic risk factor for severe COVID-19 is inherited from Neandertals. Nature.
  4. Bastard, P., Rosen, L. B., Zhang, Q., Michailidis, E., Hoffmann, H. H., Zhang, Y., … & Manry, J. (2020). Auto-antibodies against type I IFNs in patients with life-threatening COVID-19. Science.

本文亦刊載於作者部落格《盲眼的尼安德塔石匠》暨其 facebook 同名專頁

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寒波_96
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生命科學碩士、文學與電影愛好者、戳樂黨員,主要興趣為演化,希望把好東西介紹給大家。部落格《盲眼的尼安德塔石器匠》、同名粉絲團《盲眼的尼安德塔石器匠》。

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中研院19天破解新冠肺炎抗原檢測,解密四大生技平台!
研之有物│中央研究院_96
・2020/06/11 ・4215字 ・閱讀時間約 8 分鐘 ・SR值 618 ・十年級
  • 採訪編輯|歐宇甜、黃曉君;美術編輯|林洵安

中研院新冠肺炎快篩試劑與治療性抗體研發

(文章更新:2020 / 06 / 03)新冠肺炎疫情大爆發,各國盡力研發速度更快、更方便的快篩試劑。中研院團隊在短短十九天內找到可檢測病毒抗原的抗體,可應用作為快篩試劑。不過,快篩和傳統核酸檢測有什麼差異呢?為什麼能在十九天達到任務,背後有哪些生技平台的貢獻?你知道抗體不只用於快篩,還可用來開發治療藥物嗎?中研院國家生技研究園區生醫轉譯研究中心代理主任吳漢忠,為民眾一一解惑。

中研院國家生技研究園區生醫轉譯研究中心代理主任吳漢忠,為中研院 COVID-19 任務編組中,抗原檢測和治療性抗體召集人。
攝影│林洵安

核酸檢測較耗時,但準確率最高

病毒診斷試劑有好幾種,目前普遍採用核酸檢測法。採集個案的呼吸道 (痰、咽喉擦拭液等)、血液和糞便的樣本,透過 RT-PCR(反轉錄聚合酶連鎖反應)大量複製病毒 RNA 片段,「放大」病毒訊號,再檢測是否存在病毒,精準度達九成以上 。缺點是耗時久,含檢體的採集、處理到最後上機分析得到結果,平均約需四小時,由於需要特殊儀器檢測分析,且檢體可能帶有病毒,因此檢體必須依照疾病管制署及 WHO 的規範,在 Biosafety Level 2 (BSL-2) 實驗室由專業人員處理,並非每間醫院診所都可進行,檢驗能量相當有限。

中研院廖俊智院長則在新冠肺炎疫情發生之初,即快速整合國內學研單位,形成「COVID-19 合作平台」,專攻可加速檢測速度,但迫切需要研發技術的抗原和血清抗體兩大快篩檢測。

抗原檢測較快速,適合大規模篩檢

一般診所常見流感等快篩試劑,只要取口鼻分泌物,即可在十五分鐘內確認是否感染,就是一種抗原檢測。原理是:利用每種抗體只會與對應的抗原結合(如鎖與鑰匙的對應) ,只要抗原(鎖) 存在於檢體中,即使量少,抗體 (鑰匙)也能立刻結合、確認病毒存在。因此,新冠病毒快篩研發的關鍵,在於找出可與病毒抗原結合的專一抗體。

日前中研院楊安綏研究團隊的重大突破,即針對新型冠狀病毒之核衣殼(nucleocapsid)蛋白,找到具有專一辨識性的單株抗體,只會對新冠病毒有反應,不會與 SARS、MERS 或其他導致一般感冒的冠狀病毒「核衣殼蛋白」產生交叉反應。

資料來源│吳漢忠
圖說設計│黃曉君、林洵安

雖然快篩試劑只要花十五分鐘即可診斷,但它不像核酸檢測是複製大量病毒 RNA、可將訊號放大。在感染初期,可能因病毒量太少出現偽陰性。目前的流感快篩約十分鐘完成,但靈敏度約 50 – 70 % ,專一性約 90 – 95 %。不過,由於抗原快篩試劑具方便性、經濟、快速等優點,比較適合進行普篩,尤其是在醫療資源較不足的國家。

目前中研院已經將抗體檢測試劑相關研發成果交付給九家廠商,廠商正與衛福部食藥署溝通,進行後續認證,力拚三個月內上市。

血清抗體檢測,找出感染時間先後

第三種檢測稱為血清抗體檢測,是以合成的病毒抗原檢測血液中是否具有抗體。在染病後,病人體內才會出現抗體,所以這是感染中、後期才能進行的檢測方式。此法可判斷患者是否曾感染,以及依照產生抗體的種類判斷已感染多久,日前磐石艦案即用此法確認官兵感染的時間先後。

血清抗體檢測試劑原理與抗原檢測類似,只是偵測的是血液中的 IgM 與 IgG 抗體。 IgM 抗體,是人體免疫系統初次遭遇病毒抗原時,最早出現反應的抗體,大約在感染後 1-2 周出現,而且濃度會隨著清除病毒的作用遞減。然後,人體會產生第二種抗體:IgG。IgG 比 IgM 抗體更強、親和力更高、更具保護性,並可能在體內停留數月之久。

因此在抗體檢測試劑上,如果只顯示 IgM 抗體陽性,表示感染者在感染初期;只有 IgG 抗體陽性,表示在感染的後期或是恢復期;如果同時出現 IgM 與 IgG 抗體陽性,表示在感染中期或稱為感染活躍時期,目前中研院已與慈濟大學完成血清雙抗體檢測開發。

血清抗體檢測與抗原檢測的原理相似,也是用膠體金顯色,只是捕捉的不是抗原,而是抗體。測試線有兩條,分別捕捉血液中的 IgM 與 IgG 抗體,用來推測感染時間先後。
資料來源│慈濟大學
圖片重製│黃曉君、林洵安

血清抗體檢測優勢為:檢體為血液,比病毒核酸 RNA 更為穩定;抗體在血液中分佈均勻,不會有採樣點的差異;抗體可持續於血中存留數週或數月之久。不過,因為 IgM 抗體可能在感染後的一~二周才出現,期間可能出現空窗期,產生偽陰性,仍必須比對核酸檢測確認結果。但如同抗原試劑,在醫療資源不足之地區,血清檢測可及時應付當地防疫檢測所需;另外,在追溯不明感染源或是無症狀感染者,可作為核酸檢測互補之工具。

「所有檢測都有優、缺點,兩種快篩好處是病人不用等太久 ,操作簡易的優勢,使得快篩的便利性及時效性極高,儘管靈敏度沒有核酸檢測高,但緊急狀態下,做為第一層篩選,能夠加速疫情的控制。」吳漢忠解釋。

抗體既能檢測,也能治療新冠肺炎

抗體除了用來製作檢測試劑,也能治療新冠肺炎。事實上,自從第一個治療性抗體 rituximab 於 1997 年上市,至今已有八十五個抗體藥物上市,是當今新藥發展的重要方向,臺灣更是全世界少數具有能力開發抗體藥物的國家。

但不是所有的抗體都能化身為治療藥物。以新冠病毒的抗體為例,新冠病毒是靠著表面皇冠狀的棘蛋白(spike protein)與呼吸道細胞的 ACE2 受體結合,如果某株抗體與棘蛋白結合後,可抑制病毒抗原與 ACE2 受體結合,以及阻擋病毒侵入細胞,表示具有中和能力,才有機會成為治療性抗體。

但,上哪找治療性抗體?某些傳染病災難片,主角取出痊癒病患身上的血清,打到另一名患者身上,病人就神奇的痊癒了……「這次中國在新冠肺炎患者、臺灣過去在 SARS 病人身上均嘗試過取出恢復期病人血液,純化出抗體,打到重症患者身上,大幅改善症狀。不過風險很高,因為病患身上可能帶有其他病毒。最好還是研發安全有效的治療性抗體。」吳漢忠說:

中研院研究團隊已研發出十二株單株抗體,可阻斷病毒抗原結合至 ACE2 受體,並且在 P3 實驗室證實可有效抑制新冠病毒感染細胞,有機會發展成治療性抗體。

這些珍貴的單株抗體,來自中研院國家生技研究園區生醫轉譯研究中心之四大抗體技術平台,包括:噬菌體顯現法平台、高通量合成抗體工程技術平台、單一 B 細胞抗體平台以及小鼠融合瘤/抗體工程技術平台。面對此次新冠肺炎全球大流行的嚴峻挑戰,楊安綏研究團隊能夠在十九天內找出快篩試劑的關鍵單株抗體,吳漢忠研究團隊亦研發出十二株單株抗體,有機會發展成治療性抗體,這些平台功不可沒。吳漢忠強調:「此次能夠快速完成這些研究,都是長期團隊養成,加上廖院長整合『COVID-19 合作平台』,並有三次練兵的經驗,以及各實驗室協力合作的成果。」

四大平台開發診斷與治療性抗體

人類天然抗體庫平台

吳漢忠團隊從人體的骨髓、周邊血球或脾臟的 B 細胞等取得人類抗體,將抗體的部分基因(表現與抗原結合區域)插入噬菌體的基因組,再讓噬菌體去感染細菌並大量複製。複製完成的噬菌體,它們的 pIII 蛋白上就會出現人類抗體的片段,而且每個片段只能對應特定抗原。中研院以噬菌體顯現法建構的人類天然 (naïve)抗體庫,總容量已達到六百億株的有效人類抗體。

如何從茫茫的抗體大海,篩選出所需的正確抗體呢?研究員讓大量噬菌體 pIII 蛋白上的抗體片段與預訂抗原(如冠狀病毒的抗原)結合,經過三至五輪淘選,挑出最具有結合力之噬菌體。最後由 DNA 定序,確認抗體的基因序列,即可得到正確的抗體。

資料來源│諾貝爾獎官網噬菌體顯示法解說網頁
圖說重製│林洵安

噬菌體顯現法平台的優點是可大規模快速篩選,而且抗體都取自人體,臨床上可減少排斥性問題。目前中研院的研發成果已獲得超過二十項國內外專利,研發產品包括:區別四型登革熱的檢驗試劑、癌症相關的治療性抗體等等。面對此次新冠肺炎全球大流行的嚴峻挑戰,研究團隊亦運用此抗體庫在十八天內快速完成篩選,並製造十二株有機會成為藥物的人類抗體。

高通量合成抗體庫技術平台

抗原與抗體接觸與結合的部位,稱為互補性決定區(Complementarity determining region,CDR),如果抗體與抗原的親和力不佳,可運用基因工程使抗體 CDR 區域突變修正,稱為合成抗體。中研院楊安綏團隊已完成一百個合成抗體庫(Synthetic library ),每個抗體庫至少有十億種有效抗體變種。此次他即是運用數十年來累積成果和技術,日以繼夜進行抗體合成及篩選,將原本需要兩個月的研究,縮短在十九天內達標!

圖片提供│中研院秘書處

單一 B 細胞抗體平台

從病患或疫苗接種者的血液樣品中,選出能辨識抗原的記憶型 B 細胞,再用 RT-PCR 技術取得抗體的基因序列,以克隆 (cloning) 技術和抗體工程製備後,篩選出單株抗體,所需時間較短,可快速應付傳染性疾病爆發。中研院林國儀研究團隊用此法成功從老鼠體中取得可與多種流感病毒結合的單株抗體。

小鼠融合瘤/抗體工程技術平台

把抗原打入小鼠體內、誘發免疫反應並產生抗體,然後取出小鼠脾細胞和骨髓癌細胞融合,透過融合瘤細胞可不斷增生的特性來獲得單株抗體,若得到具有中和能力的單株抗體,可進一步運用抗體工程技術改造成人類化的治療性抗體。目前中研院研究團隊在極短的時間內,已成功生產 60 株對抗棘蛋白(spike protein)及 47 株對抗核衣殼(nucleocapsid) 之單株抗體,這些單株抗體對於新冠肺炎的診斷及治療將有重大助益。

這一波是求快,接下來要求好,希望未來研發準確度、靈敏度更好的診斷試劑以及安全有效之治療性抗體,以因應下一波疫情到來 。

如今在中研院裡,快篩試劑和抗體藥物等各項研發工作,正如火如荼進行。吳漢忠表示,新興傳染病出現的頻率越來越高,造成的疫情亦日趨嚴峻。未來將建全抗體平台與 P3 等級生物實驗室的編制內常駐人力,接受完整訓練,並且定期模擬演練快速研發抗體與確效之流程,以期當新興傳染病發生時,可具時效性抑制其擴散與爆發,降低疫情對國人健康與社會經濟之衝擊。

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本文轉載自中央研究院研之有物,原文為《【中研抗疫3】抗原檢測 19 天破解,原來背後有這些大平台》,泛科學為宣傳推廣執行單位

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結構強化的病毒,傳染力更強——冠狀病毒的D614G突變(下)
寒波_96
・2020/08/07 ・3301字 ・閱讀時間約 6 分鐘 ・SR值 545 ・八年級

導致 COVID-19(武漢肺炎、新冠肺炎)的 SARS-CoV-2 冠狀病毒「SARS二世」,最近一批研究認為,出現在 S蛋白質上(spike protein)的一個突變「D614G」有助於適應,增加病毒的傳染力。1, 2

上集:世界各地都取得優勢,不只是運氣好?——冠狀病毒的D614G突變(上)

美國的斯克里普斯研究所(Scripps Research Institute)的科學菁英戰隊,以人造的模擬病毒和基因改造細胞做實驗,證實 D614G 確實能提高病毒的感染能力。3, 4

SARS二世病毒入侵細胞的過程。圖/取自 Profile of a killer: the complex biology powering the coronavirus pandemic

病毒如何感染細胞?SARS二世病毒感染的關鍵 S蛋白質,可分為 S1、S2 兩部分。S1 中有一段能辨識特定目標的短序列,會直接和細胞表面的 ACE2 受器結合。接著細胞上的「酵素」會把 S1 切除,讓後面的 S2 與細胞膜合體,病毒才能將遺傳物質輸入細胞,順利入侵。

如果病毒是可樂娜啤酒:瓶口、瓶蓋、開罐器

想像成在喝可樂娜啤酒,假如可樂娜的瓶蓋是 S1,瓶口是 S2,酵素是開罐器,嘴巴就是細胞的 ACE2 受器。可樂娜要移動到嘴巴附近,由開罐器打開瓶蓋後,瓶口對準嘴巴,才能喝到可樂娜。

SARS二世的前輩 SARS一世病毒也與 ACE2 結合,但是過程不同。SARS一世用 TMPRSS2 酵素當開罐器,SARS二世則用 furin 酵素。差異在於,SARS二世的 S1 和 S2 中間多出一小段序列,可以讓 furin 作用。

SARS二世病毒的 S1、S2 之間,多出一小段可以讓 furin 作用的位置。圖/取自 ref 3

D614G讓瓶蓋瓶口結合更穩定,增加感染成功率

SARS二世用 furin 作開罐器的效果更強,缺點是 S1 和 S2 中間多出一段後變得不太穩固,就像喝可樂娜時,還沒對準嘴巴,瓶蓋已經從瓶口脫落,可樂娜就喝不到惹。不過 D614G 突變後能彌補這個缺點,讓瓶蓋與瓶口的結合更穩定。

D614G 突變位於 S1,不過很靠近 S2。以人造模擬病毒感染人類細胞株的體外實驗發現,D614G 應該不影響 S1 與細胞的結合,卻能讓 S1 的結構更穩定。證據是:S蛋白質如果配備 D614G 突變,S1 與 S2 的比值(S1:S2)明顯較高,幾種分析方法的比值都超過原本三倍。

可樂娜!圖/取自 junk DNA

新突變能穩固 S1、S2 的結合,使得 S1 不容易半途脫隊(shedding),藉此增加感染成功的機率。

情況好像運送 100 瓶可樂娜,原本半路上 70 瓶的瓶蓋會掉下來,只有 30 瓶能抵達目標;但是改版後只有 20 瓶會脫落,高達 80 瓶能接近嘴巴。如此一來,即使可樂娜本身沒有更吸引人,光是順利抵達目標的啤酒數量大增,就能讓喝到可樂娜的人數成長數倍。

D614G 突變怎麼讓結構更穩定?論文推論,第 614 號氨基酸突變後,旁邊的第 613 號麩醯胺酸(glutamine,Q)會與 859 號蘇氨酸(threonine,T)形成氫鍵,讓整個結構更有彈性。另外,原本的 D614 可能與第 464 號精氨酸(arginine,R)形成立體障礙,干擾 S1 和 S2 的結合,突變後障礙也就消失了。

S蛋白質的立體結構,第 614 號氨基酸靠近 S1、S2 的交界,由 D 改變為 G 以後,也會影響周圍氨基酸的化學鍵結。圖/取自 ref 3

小小改變,增加病毒傳染力

突變的效果很微妙,大部分突變影響都很有限,有時候在特定機緣下,光是一處小小的變化卻會帶來很大的差異。

假如 SARS二世和一世相同,S1 和 S2 之間沒有多出一段序列,兩者的結構仍然能保持穩定,卻會因為開罐器較弱而限制感染力。增加 furin 牌開罐器的作用位置後,開罐效果提升,也帶來結構不穩定的副作用;而 D614G 的出現,能有效彌補缺點

因此,S1 和 S2 之間插入短片段序列導致的新 furin 切位,以及 D614G 的位置變化,可以視為病毒一系列相關的適應。

然而要注意,體外實驗的感染力變強 3 倍、10 倍,不等於病毒實際人傳人時也會增強 3 倍、10 倍。針對 3 萬人的一項英國研究,比較兩款病毒傳播上的不同,估計配備 D614G 突變的病毒傳染力為本來 1.22 倍。但是愛丁堡大學的 Andrew Rambaut 認為,假如真的比較強,效果也不是太大……等等,1.22 倍不大!?5, 6

斯克里普斯研究所的菁英戰隊外,還有多個其他戰隊用類似的模擬病毒測試差異,得到一致的結論:

至少人造情境下 D614G 能增加感染力。

更堅固的可樂娜!(誤)圖/取自 junk DNA

另一個眾人關心的問題是,現在大家都在研發疫苗,突變會不會影響抗體作用?感染病毒後痊癒者的血漿內有抗體,不同戰隊各自用少數痊癒者的血漿測試,發現都不會影響中和抗體(neutralizing antibody)的作用。

不過一個中國戰隊卻報告,70 個測試樣本中有 5 個(7%)效果較差。由此推論,D614G 突變多半不會影響抗體的效果,但是測試過還是比較安心。7, 8, 9

SARS二世立足中國,歐洲進修,征服世界

至今已經觀察到 SARS二世出現過非常非常非常多的突變,但是與適應有關的改變,目前只有 D614G 看來比較有眉目。假如 D614G 確實能增強病毒的傳播能力,表示隨著疫情進展,此一變異的比例增加與病毒的適應有關,是正向選汰(positive selection)的結果。

兩款病毒在全世界的相對比例變化,橘色是原本的 D,藍色是衍生的 G。圖/取自 ref 1

大家聽到病毒傳染力增強也不用緊張,因為 D614G 在疫情很早期時已經出現,中國外絕多數大地方都以這款病毒為主。我們所熟悉的疫情,其實大部分就是由這款病毒所致

換句話說,中國雖然是 SARS二世的起源地,隨後在世界各地廣傳的病毒,傳染力很可能比武漢最初的病毒更強。若真是如此,意思是中國、韓國的本土病例儘管一開始數量非常驚人,傳染力實際上不如其他地方的後起之秀?

5 月 16 日時世界疫情的累積紀錄,綠色是原本的 D,黃色是衍生的 G。韓國流行的病毒,一直以原始版的 D 為主,中國早期的疫情也是。圖/取自 Nextstrain

D614G 最早在一月底誕生,歐洲是它茁壯的溫床。由已知資訊可以推論,全世界的傳染源,2 月之前以來自中國的病毒為主,但是 3 月以後歐洲成為出口最大宗。大致上是:SARS二世首先立足中國,接著 D614G 突變在歐洲發揚光大,後來征服世界。

另一點重要的發現是,D614G 能增加傳染力,卻對殺傷力沒有影響;這點仍需要更多研究證實,不過並不意外。對病毒而言,在周圍有這麼多同類競爭對手之下,增加傳染力很有利,強化殺傷力卻不是優點。

延伸閱讀

參考資料

  1. Tracking changes in SARS-CoV-2 Spike: evidence that D614G increases infectivity of the COVID-19 virus
  2. Spike mutation pipeline reveals the emergence of a more transmissible form of SARS-CoV-2
  3. The D614G mutation in the SARS-CoV-2 spike protein reduces S1 shedding and increases infectivity
  4. Mutated coronavirus shows significant boost in infectivity
  5. The pandemic virus is slowly mutating. But is it getting more dangerous?
  6. COVID-19 Genomics UK (COG-UK) Consortium  Report #9 – 25th June 2020(pdf
  7. D614G mutation of SARS-CoV-2 spike protein enhances viral infectivity
  8. Naturally mutated spike proteins of SARS-CoV-2 variants show differential levels of cell entry
  9. The Spike D614G mutation increases SARS-CoV-2 infection of multiple human cell types

本文亦刊載於作者部落格《盲眼的尼安德塔石匠》暨其 facebook 同名專頁

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寒波_96
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生命科學碩士、文學與電影愛好者、戳樂黨員,主要興趣為演化,希望把好東西介紹給大家。部落格《盲眼的尼安德塔石器匠》、同名粉絲團《盲眼的尼安德塔石器匠》。