應用 CRISPR基因編輯技術檢測 COVID-19:具革命性的 STOP 技術簡介

最近一則檢測新型冠狀病毒(COVID-19)技術的科技新聞相當吸睛:由美國華裔科學家張鋒所創辦的SHERLOCK (Specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking) 公司成功獲得美國食品藥物管理局(FDA)的緊急使用授權(EUA)1,得以將 CRISPR註1應用在於新冠狀病毒檢測。FDA 也在官網稱此為首次授權 CRISPR 技術使用於傳染疾病檢測2

  • 想了解更多EUA的話,在 fdacollege 有更為詳細的介紹

CRISPR 比傳統的 RT-qPCR 檢測時間更短、成本費用更便宜,且準確度非常高,因此檢測技術被視為非常大的突破,未來也極可能應用在各樣檢測。有鑑於目前尚未有文章介紹 CRISPR 這類革命性技術應用在的體外診斷醫材上,筆者歸納  SHERLOCK 公司公開的部分 CRISPR 技術以供讀者一窺其卓越性。

請注意: 本文所介紹的 STOP 檢測法,雖非美國 FDA 授權緊急使用授權的檢測法,但因張鋒教授在 STOPCOVID 官網3所提供的圖文資訊最完整,且檢測概念相似,因此以此加以說明。若您對緊急使用授權給 SHERLOCK的 CRISPR 檢測法有興趣,請上 FDA 官網查詢。

新冠狀病毒檢測技術傳統上採 RT-PCR 法,準確度雖高,但需費時三至四小時。在分秒必爭、人命關天的情形下,漫長的等待對醫療體系是沉重的負擔。

美國麻省理工學院的張鋒教授所領軍成立的 SHERLOCK 公司,擁有一種稱 STOP3,4 (SHERLOCK Testing in One Pot)的 CRISPR 檢測技術。 該技術能將檢測時間降至約一小時。檢測靈敏度和專一性也與舊技術不相上下,且成本低於上千台幣的舊技術。

圖/CRISPR三巨頭

張鋒教授來自中國河北石家庄,1982 年出生,1993 年隨父母到美國愛荷華州首府德梅因市。哈佛大學學士、史丹佛大學博士。2017 年即成為麻省理工的終身教授,且不到四十歲就已經是美國國家科學院士了。

他拿過的獎項無數,也是現今 CRISPR 領域的三巨頭(另外兩位為加州大學柏克萊 Jennifer Doudna 教授和德國馬克斯-普朗克協會的 Emmanulle Charpentier 教授)。張教授也被視為將來很有可能問鼎諾貝爾獎的人選之一。其在 CRISPR 的專利之爭更像一部經典故事,他與他的同伴從合作走到對立的專利之爭都非常具有話題性。

CRISPR 戰場從專利延伸至體外檢測

除了張鋒教授所領導的團隊外,在美國另一端的舊金山灣區,同時有另一組人馬正在開發類似的技術。該團隊的領導人不是別人,正是 CRISPR 三巨頭之一的 Jennifer Doudna 。

圖/DETECTR, SHERLOCK 和美國疾管局 qRT-PCR 所需時間比較。

多年來,Jennifer Doudna 教授和張鋒教授一直在 CRISPR 的專利上攻防,現在競爭關係已經延伸到新冠病毒的檢測上。Dr. Doudna 所創辦的公司 Mammoth Bioscience 開發出的檢測平台(DETECTR)也刊載在知名期刊英國自然〈Nature〉上。該平台的所需的檢測時間甚至更少,可以壓在一小時內。

Mammoth Bioscience 目標是提供充足的 DETECTR 給醫療系統以緩解美國當前病毒檢測套件嚴重不足的情形,更進一步希望能推展到不用處方即能讓大眾在在藥局買到該診斷醫材。Mammoth Bioscience 也和英國藥廠葛蘭素史克(GSK)合作向美國 FDA 提出 EUA 申請,雖然目前還在審查中,但可以預期的是,要拿到 EUA 許可應該只是時間早晚的問題。5,6,7

STOPCovid 技術的特點

SHERLOCK 開發出的 CRISPR 檢測技術(STOPCovid)有幾個特色

  • 快速:從開始到結束可以在一小時左右完成
  • 敏感度:和 RT-qPCR 比較,也能做到偵測到 100 Copies 的病毒 RNA.
  • 簡單易操作:簡單到像用驗孕棒一樣,他們將產品做到非常容易使用的地步。
  • 低成本:每次測試在十美金以下。
  • 規模化:可以快速的完成大量的檢測。

不同檢測技術的比較。圖/stopcovid.science

上圖比較了傳統的血清抗體測試、CRISPR 技術和 RT-qPCR 三種不同的檢測方法。從採樣、結果、方便性、速度和價格上來討論。

我們就直接依各項比較給大家看一下,就能馬上看懂:

  • 採樣:CRISPR=RT>血清
  • 結果:CRISPR=RT>血清
  • 便利性:CRISPR=血清>RT
  • 速度:血清>CRISPR>RT
  • 價格:血清=CRISPR>RT  (CRISPR大約十美金一次檢測,血清檢測再便宜也便宜不了多少。)

CRISPR 在所有項目幾乎完勝所有比較的檢測方式。

那最重要準確度呢?

目前 CRISPR 正在進行更多的臨床驗証部份,但截至當下,SHERLOCK 的 STOP 檢測技術達到 97% 的敏感度和 100% 的專一性。這和其他已拿到 EUA 的檢測方式幾乎具有相同的敏感度。

STOP檢測方式

(以下所有圖片取自 stopcovid.science

SHERLOCK 開發的檢測技術非常容易操作,是透過鼻腔黏膜或唾液進行採樣放入收集液中,然後轉到 SHERLOCK 管內後加熱到 60 度一小時。將溶液滴在檢測器上進行測試。

測試步驟

第一步:樣品採集

將唾液或鼻中收集到黏膜放入含有緩衝液的反應管中,該緩衝液會破壞 SARS-CoV-2 病毒顆粒,使 RNA 暴露出來以方便進行之後步驟的檢測。

第二步:擴增和CRISPR偵測

(a)核酸擴增:使用一種名為 Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP 的擴增方法,將採集檢體中少量病毒 RNA 擴增數十億倍。此方法與美國疾管局 CDC 所認可的其他新冠病毒測試所用的傳統 PCR 方法是不同。LAMP 不但不需要用到龐大的儀器設備,也不需要上上下下的溫度變動,只需要在 60 度下一小時即可。

(b)CRISPR偵測:一種名為 Cas12b 的 CRISPR 酶,會辨識擴增的新冠病毒核酸。識別後,Cas12b 會將一段由兩個重要分子 FAM 分子生物素(Biotin)所形成的特定報告分子(report molecular)剪開來。

第三步:檢體測試

將擴增和檢測到的樣本(第二步驟)加到檢測條上,測試樣本便會開始往檢測區方向流動。

第四步:抗體-報告分子識別

當樣品向上流動時,在檢測條底部的帶金抗體(抗體為搭載和金的結合體,因此可以看到它們)會與檢測樣本中的報告分子中的 FAM 結合。

第五步:對照組

如果步驟四中的帶金抗體有結合到完整的報告分子 FAM,則它將會卡在檢測條的第一條線上(C)。在這條線上帶有抗生蛋白鏈菌素(streptavidin),它會抓住在報告基因的生物素。如果生物素在抗體識別之前就己經從報導基因上切下來的話,抗體將繼續沿檢測條向上流動。

第六步:測試組

在步驟五中任何成功離開對照組控制線的抗體都將在測試區的測試線上被抓住。在測試線處,是一個可與任何剩餘抗體-報導分子偶合物結合的分子。

解釋結果

如果樣品中含有 SARS-CoV-2核酸,則 CRISPR 酶將破壞 FAM 與報告基因上生物素之間的鍵。任何被剪斷的報導分子都會導致檢測器上的抗體結合在第二條線上(測試線)而不會是在第一條(對照)。在測試線(T)上的顯示樣品為 COVID 陽性,而測試線上沒有東西則表示樣品為 COVID 陰性。


同場加映:什麼是 CRISPR ?

根據哈佛大學以及 MIT-哈佛的合作聯盟機構 Broad institute 針對 CRISPR8,9有明確的定義。

CRISPR(讀作 crisper)全名為 常間回文重複序列叢集/常間回文重複序列叢集關聯蛋白系(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins),為存在於细菌中的一種短片段重複基因,該類型基因組中含有曾經攻擊過該細菌的病毒的基因片段,CRISPR 序列看似無害,但卻是細菌免疫系統的關鍵組成部分。

細菌透過這些基因片段來偵測並抵抗相同病毒的攻擊,並消滅病毒。這類基因組是細菌免疫系统的關鍵組成部分。透過這些基因组,人類可以準確且有效地編輯生命體内的部分基因,也就是 CRISPR/Cas9 基因編輯技術。換句話說這個細菌防禦系統的印記,是構成 CRISPR-Cas9 基因組編輯技術基礎的。

在基因組工程領域,專業術語「 CRISPR」或「CRISPR-Cas9」通常被寬鬆地通稱在各種 CRISPR-Cas9 和 -CPF1(及其他)系統,這些系統可以編輯特定位置的基因片段(例如用於新的診斷工具)。至於 Sherlock 所用的 CRISPR/Cas12b 和 CRISPR/Cas9 有些不同,Cas12b 可以辨別特定片段的序列且不只可以剪斷該段基因,甚至可以一同切掉附近的單股 DNA,使得 Cas12b 有能力剪輯出報導基因。

使用這些系統,研究人員可以永久性地修飾細胞和生物體中的基因,並且在未來可能可以精確的修正人類基因中的突變,進而治療遺傳性疾病。現在也開始有更多其他系統可以使用,例如 CRISPR-Cas13,此系統可鎖定在 RNA,並已經開始被使用在診斷醫材上(例如SHERLOCK)。

參考資料

  1. SHERLOCK的緊急使用授權
  2. FDA 對Sherlock的EUA介紹Coronavirus (COVID-19) Update: Daily Roundup May 7, 2020
  3. STOP檢測法:STOP Covid │About US
  4. MIT對STOP法的介紹:MIT News SHERLOCK-based one-step test provides rapid and sensitive Covid-19 detection
  5. CRISPR pioneer Doudna opens lab to run Covid-19 tests
  6. Mammoth Biosciences partners with GSK to develop handheld CRISPR-based COVID-19 test
  7. A protocol for rapid detection of the 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2 using CRISPR diagnostics: SARS-CoV-2 DETECTR
  8. 哈佛大學對CRISPR定義:CRISPR: A game-changing genetic engineering technique
  9. BROAD對CRISPR的定義:QUESTIONS AND ANSWERS ABOUT CRISPR
  • 作者/愛姆斯的醫材藥品法規世界,愛姆斯有超過十年醫藥法規經驗,工作經驗遍及海內外生技藥品臨床醫材公司。
  • 協作及審閱/Minxi Rao 為加州大學柏克萊分校化學博士,杜克大學化學學士;目前美國 Medler Ferro Woodhouse & Mills PLLC擔任 Patent Agent。

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