「看見」大腦記憶的生成──超解析 3D 層光定位顯微鏡

  • 撰文|呂杰翰、黃鈺珊、呂萱萱;美術編輯|林洵安

超解析 3D 層光定位顯微鏡

中研院江安世院士、應用科學研究中心陳壁彰助研究員,共同開發了「透化層光定位顯微鏡」,一次解構果蠅全腦的多巴胺神經網路,並可「看見」記憶蛋白在特定神經細胞突觸上的新生,此新技術可望揭開大腦記憶機制的神秘面紗。研究論文已於去(2019)年 10 月 18 日刊登在《自然通訊》(Nature Communications)。跟著研之有物一起來了解!

一個細微的動作、一絲情緒起伏,都是由千絲萬縷的神經網路,以及大量訊息傳遞的化學分子交錯作用的結果。早期心理學家要解析人類的大腦意識活動,必須對照研究對象的夢境和生活史。然而,大多數人一起床夢境就忘掉八成,還要將夢境和更久遠的童年記憶連繫起來,說佛洛伊德有多心累都不為過。

人類的任何情緒和行為,都是大腦千絲萬縷的神經網路,以及大量訊息傳遞的化學分子交錯作用的結果。
圖片來源│iStock

如今神經科學家有螢光蛋白與基因工程等工具在手,可先給予模式生物(如果蠅)特定刺激,然後用螢光定位腦內參與活動的生化分子(如某些與記憶有關的蛋白質分子),了解刺激前後分子如何重新分布,以此推測它們在腦部活動中所扮演的角色。

  • BUT!因為可見光無法穿透較厚的組織,過去研究者只能將腦組織切成薄片,才能用顯微鏡觀察。但切片會破壞大腦的整體性,無法忠實呈現完整的神經結構。

國立清華大學腦科學研究中心、中研院院士江安世與中研院應用科學研究中心助研究員陳壁彰,合作研發出可透視果蠅全腦的超解析 3D 層光定位顯微鏡,並利用化學方法把果蠅大腦變「透明」、可見光能通過,終於得以窺見果蠅腦部深處被螢光標定的單分子神經,藉此建構果蠅全腦神經網路地圖。

去年團隊藉著這項技術,「看見」記憶蛋白在大腦深處特定神經細胞突觸上的新生,初步揭開大腦記憶的神秘面紗。

精彩故事,是這麼開始的……

解析度、廣度,統統都要!

先來說說傳統顯微鏡的問題!傳統光學顯微術能夠解析的最小距離,大約 250 奈米左右。也就是說,如果兩個發光分子之間的距離小於這個極限,因為光波的繞射特性會使分子影像變得模糊。這個鑑別距離極限,定義了光學成像的「解析度」。

傳統光學顯微術的「繞射極限」,硬生生地限制了科學家一窺腦部全貌的夢想。

大腦神經突觸的大小約在 20 到 40 奈米之間,與腦部分子活動相關的神經結構尺度也在數十奈米。可想而知,運用傳統「粗線條」的光學顯微術觀察大腦,一定會有「見林不見樹」的問題:即使可知大致的神經走向,也無法得知細微變化。但魔鬼,就是藏在細節裡啊~~

另一方面,傳統顯微鏡還有視野廣度或視野大小的問題。神經突觸的大小是果蠅大腦 ( 約數百微米 ) 的數千分之一。想要解析特定分子在大腦的分布,困難度就像用小小無人機空拍一個籃球場,還要定位籃球場上每隻螞蟻的正確位置。

但在顯微鏡的世界裡,解析度和視野廣度本是兩個極端,想要一種技術、兩種滿足,必須找到非比尋常的解決之道。

關關難過關關過

首先,這種顯微技術必須能夠定位腦神經細胞中個別分子。衡量各種超解析顯微術的優勢與適用範圍,「單分子定位顯微術」(single molecule localization microscopy) 具有數十奈米等級的空間解析度,得以鑑別相距約 20 奈米的分子,恰好符合神經生物學家對解析度的要求,無疑是首選工具。

圖片來源│ 呂杰翰
圖說美化│林洵安

再者,因為神經網路遍佈全腦,並非僅侷限在大腦的表層,此顯微術必須能看得又深又清楚,才能重建果蠅大腦完整的三維影像,提供全面而精密的分子地圖。近年熱議的「層光顯微術」( light-sheet microscopy ) 可快速取得大範圍樣品的影像,成為不二首選

有關層光顯微鏡的介紹,請見研之有物另一好文〈灑下百道層光,一窺微觀世界的生命律動:「晶格層光顯微鏡」如何為細胞拍攝寫真集〉。

再加上,江安世院士團隊透過生物組織澄清技術,運用化學方法讓果蠅腦變透明、能讓可見光通過,然後以層光掃描透明大腦,輔以上述單分子定位顯微術,即可在短時間內偵測大腦內的個別分子位置,稱為「透化層光定位顯微鏡」。

中研院應用科學研究中心陳壁彰助研究員與透化層光定位顯微鏡。
圖片來源│中研院秘書處

跨領域合作,打開大腦的潘朵拉盒子

有了既定的策略,抽象的概念立刻轉化為一個跨界、甚至跨國的技術整合問題。

陳壁彰助研究員與江安世院士合作,將一個由國家實驗研究院儀器科技中心打造的特殊顯微物鏡,整合入實驗室既有的掃描式貝色層光顯微鏡 (Scanning Bessel beam light-sheet microscope),建構出針對透明化樣品最佳化的超解析顯微鏡。

並應用日本東京大學 Yasuteru Urano 團隊開發的新型閃爍螢光染劑 HMSiR 標定腦內分子,讓每一個參與大腦記憶生成的分子,發出清晰且明亮的光訊號。

論文第一作者、現任國立清華大學生醫工程與環境科學系助理教授朱麗安興奮地說:身為一個生物學家,使用自己建造的顯微鏡系統,就像打開潘朵拉的盒子,突然什麼都變成可能!

因為商用顯微鏡大多有鏡頭選用、解析度等限制,尤其層光顯微鏡在鏡頭選擇上更是有諸多限制。

那麼,這項新的顯微鏡系統,會對神經科學帶來什麼改革呢?

首先,神經訊號的傳遞仰賴神經突觸電位及神經傳導物質的傳遞,想要了解大腦的活動,必須解析突觸上的細微變化,如蛋白質的生成。以模式生物果蠅為例,神經突觸只有幾百奈米,過去只能仰賴電子顯微鏡。

但電子顯微鏡的樣品製備非常繁複,並需要將組織切片,無法呈現完整的神經結構,一次能看的樣品範圍也很小。電子顯微鏡的另一個問題是「很花時間」。美國珍利亞農場研究園區 (Janelia Research Campus) 所做的全果蠅腦電子顯微鏡連續切片影像,單一個果蠅腦就需花費 16 個月拍攝完成,再經過無數的工程師進行影像處理,不利於統計分析。

果蠅全腦多巴胺神經多尺度圖像(上),細部的神經結構(左下),以及放大展現出非常複雜、但可經由新顯微術辨識的神經網路(右下)。
圖片來源│陳壁彰

透化層光定位顯微鏡,可在比細胞大將近一萬倍的組織(如果蠅大腦),定位其中所有蛋白質分子,進行果蠅全腦的攝影。而且全腦攝影可在一天之內完成,期間僅需移動樣品四次,大幅降低機械移動造成的誤差與後續影像處理的複雜性。與傳統的顯微技術比較,新技術能在合理的時間內拍攝大量樣品,即時提供生物學家更大的統計樣本。

去 (2019) 年初已初步告捷!新的顯微技術一次解構果蠅全腦的多巴胺神經網路,「看見」記憶蛋白在特定神經細胞突觸上的新生,可望揭開大腦記憶機制的神秘面紗。

看見記憶、解密大腦疾病

昆蟲腦部的蕈狀體分布了一種囊泡單胺運轉蛋白質 (vesicular monoamine transporter),與昆蟲的嗅覺與記憶功能息息相關,是一種在腦部負責訊息傳遞的重要分子。只要標定這種蛋白質分子的精確位置,即可從中歸納出與記憶有關的分子機制。

本次研究發現:在讓果蠅進行特定的記憶訓練後,只有特定的神經突觸會增加囊泡單胺運轉蛋白質表現,顯示這些神經在記憶過程可能肩負重大功能。

藉由類似的實驗,神經科學家可以釐清神經變化和特定腦部活動的關聯,進一步理解神經在腦部記憶生成的機制,以及神經可塑性 (placiticity) 的變化,破解大腦記憶之謎。

左圖是超解析之果蠅眼部單一神經,右圖是超解析全腦囊泡單胺運轉蛋白在神經上的分佈。
圖片來源│Rapid single-wavelength lightsheet localization microscopy for clarified tissue

另一方面,由於鼠腦被普遍使用於與人類腦部疾病有關的研究,未來江安世院士研究團隊也計畫以此探索老鼠腦,揭密與蛋白質分布有關的機制,對於解答部分人類腦部疾病做出貢獻!

「目前為止,我們已經觀察果蠅在訓練前後的神經活動,並且能夠分辨尺度在數十奈米左右的變化,這對釐清分子在神經可塑性中扮演的角色提供很大的幫助。」朱麗安期許未來:「十年後的目標是將影像解析度提升到 10 奈米,並試著應用於活體,即時觀察神經在腦部活動下的重塑,終極目標是理解學習行為的詳細機制!」

也許不遠的未來,新的顯微技術可以觀察生物學習當下發生的每一個細微腦部變化,解密人之所以為人,是如何從經驗學習成長。

延伸閱讀

本文轉載自中央研究院研之有物,原文為《「看見」大腦記憶的生成—-超解析 3D 層光定位顯微鏡》,泛科學為宣傳推廣執行單位

關於作者

研之有物│中央研究院

研之有物,取諧音自「言之有物」,出處為《周易·家人》:「君子以言有物而行有恆」。探索具體研究案例、直擊研究員生活,成為串聯您與中研院的橋梁,通往博大精深的知識世界。 網頁:研之有物 臉書:研之有物@Facebook

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