基因編輯一定有風險,評測 CRISPR 工具的脫靶率

  • 本文來自《领研网》。撰文/戚譯引。

中國科學家發表兩篇 Science 論文,對多種基因編輯工具進行「測評」。兩項研究都指出,被學界看好的單鹼基編輯工具有著極高的脫靶風險,其中一項還提出了全新的脫靶率檢測技術「 GOTI 」。

圖/pixabay

CRISPR 基因編輯技術已經發展出多種形式,然而它們都隱含著同樣的風險,那就是脫靶(off-target——意外編輯了基因組中其他的基因,造成不可預測的後果。在去年底引發巨大爭議的賀建奎事件中,許多科學家就表達了同樣的擔憂:這次編輯究竟有沒有發生脫靶?你怎麼證明沒有脫靶?

學術界早就意識到脫靶問題的存在,但量化評估十分困難。3月1日,中國科學家為主的兩個團隊在 Science發表論文,每篇論文只有兩頁,卻揭示了同一個重要的資訊:

基因編輯有風險,其中單鹼基編輯系統(base editor)脫靶尤其嚴重。

什麼是單鹼基編輯?

單鹼基編輯技術由 CRISPR-Cas9 改進而來。CRISPR 技術的基本原理,就是用 RNA 引導 Cas9 等核酸內切酶對 DNA 上的目的地區域進行編輯,可以刪除或啟動目標基因。核酸內切酶有許多種,Cas9 是其中最早被發現、應用最廣泛的,此後被發現的酶還有 Cpf1、Cas12b、Cas13 等。

Cas9 同時對 DNA 的雙鏈進行剪切,形成雙鏈斷裂(double strand breaks,DSBs),修復的過程中容易產生新的突變。而單鹼基編輯器對 Cas9 進行了改進,並添加了脫氨酶(deaminase),只對 DNA 的一條鏈進行切割,然後精確地對一個鹼基進行修改。

去氧核醣核酸(DNA)的雙股螺旋結構。在該結構中的原子是按元素進行顏色編碼,還有兩個鹼基對的詳細結構示於右下角。圖/wikimedia

根據目標鹼基的不同,單鹼基編輯工具可分成兩類,一類是胞嘧啶單鹼基編輯器(cytidine base editor,CBE),將胞嘧啶(C)轉換成胸腺嘧啶(T);另一類是腺嘌呤鹼基編輯器(adenine baseeditor,ABE),將腺嘌呤(A)轉換成鳥嘌呤(G)。

單鹼基編輯看起來操作更精確,因而被寄予厚望。但這次的兩篇 Science 論文對不同編輯技術的脫靶率進行了評估,發現胞嘧啶單鹼基編輯器具有極高的風險。

全基因組範圍的脫靶效應:自然突變的兩倍

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中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞團隊用水稻進行實驗,發現 CBE 會引發全基因組範圍的脫靶效應,其引發的突變數量大約是自然環境下發生突變的兩倍(DOI: 10.1126/science.aaw7166)。

高彩霞團隊借助全基因組測序技術,對三種應用廣泛的單鹼基編輯工具 BE3、高保真 BE1(HF1-BE3)和 ABE 進行了檢驗。與野生型對照組和 ABE 相比,BE3 和 HF1-BE3(均屬於 CBE)引發了數量顯著更多的單核苷酸變異(single nucleotide variant,SNV),主要是將基因組中其他部位的胞嘧啶也變成了胸腺嘧啶。

研究還發現,脫靶預測演算法 Cas-OFFinder 預測並不準確。在接受 BE3 編輯的植株中,只有 6 處突變發生在預測的 3 個突變部位中;而在接受 HF1-BE3 和 ABE 編輯的植株中,沒有一處突變發生在預測的部位中。

GOTI:評估脫靶的新方法

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中國科學院神經科學研究所楊輝團隊和史丹佛大學 Lars M. Steinmetz 團隊合作的研究,也得出了相似的結論:Cas9 和 ABE 引發的單核苷酸變異較少,而 CBE 讓突變的數量翻了 20 (DOI: 10.1126/science.aav9973)。

該研究的另一亮點在於提出了全新的脫靶評估技術 GOTI(Genome-wide Off-target analysis byTwo-cell embryo Injection):在小鼠胚胎卵裂球的二細胞期,對其中一個細胞進行基因編輯,並進行螢光蛋白 tdTomato 標記;隨後,在胚胎發育的第 14.5 天用流式細胞儀(FACS)將兩個細胞的子代進行分離,分別進行測序。

借助 GOTI 技術,科學家第一次能夠對脫靶進行全面的量化評估。楊輝團隊對 CRISPR-Cas9、BE3 和 ABE7.10 進行了檢驗,全部 12 組中發生的插入/缺失(indel)數量在 0 到 4 之間,並且沒有一個發生在預測的脫靶部位。

實驗發現,在經過 BE3 編輯的胚胎中平均發生 283 個 SNV;相比之下,經過 ABE7.0 編輯的胚胎平均發生 10 個 SNV,與自然突變的數量無顯著差異。而且, BE3 編輯引發的一些突變發生在原癌基因或抑癌基因上,這進一步提示了可能的致癌風險。

臨床應用要謹慎

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Science 採訪了業內人士對此的看法。

  • 哈佛大學化學家、第一代鹼基編輯器的發明者劉如謙(David Liu)認為:基因編輯的錯誤整體上仍屬罕見,不太可能對實驗室應用造成影響,但足以為那些想要在病人身上進行試驗的人敲響警鐘。
  • Cas-OFFinder 的發明者、來自韓國國立首爾大學(Seoul National University)的 Jin-Soo Kim 說:「這兩篇論文很有趣,也很重要。現在重要的是找出是哪一種成分引發了其他突變,以及如何減少或消除它。」
  • 麻省總醫院(Massachusetts General Hospital)病理學家、劉如謙的合作夥伴 J. Keith Joung 認為:對編輯器中的脫氨酶或其他成分進行改進或許能夠減少脫靶效應。

基因編輯療法被寄予厚望。在治療鐮刀形紅血球貧血症萊伯氏先天性黑蒙症方面,相關治療手段已進入臨床試驗階段。而這兩項研究進一步提示了基因編輯技術可能存在的風險,再次說明了在投入臨床應用前進行充分安全性評估的必要性。


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