「DNA編輯大師」張鋒與CRISPR / Cas9 / Cas9基因編輯技術

本文轉載自中央研究院「研之有物」，為「中研院廣告」

• 採訪撰文｜寒波
• 責任編輯｜簡克志
• 美術設計｜蔡宛潔

自閉症研究的新方向

臺灣民眾大概都聽說過「自閉症」這個名詞，自閉症是腦部發育障礙導致的複雜疾病，同時受到先天遺傳以及後天環境因素的影響，具體成因依然是個謎，科學家須對遺傳調控方面有更多了解。中央研究院「研之有物」專訪院內基因體研究中心的莊樹諄研究員，他的團隊結合生物學、資訊學以及統計學方法，發現自閉症的風險基因與 RNA 之間有複雜的交互作用，在自閉症患者與非患者的腦部有很大差異。如果持續研究 RNA 的調控機制，或能開闢新的方向進一步理解自閉症。

遺傳性疾病成因——致病基因

根據衛生福利部 2023 年統計數據，我國自閉症患者超過一萬九千人。自閉症的全稱為「自閉症譜系障礙（autism spectrum disorder，簡稱 ASD）」，常見症狀是溝通、表達、社交上有困難，經常出現反復固定的狹窄行為，目前尚無有效的治療藥物。雖然經典電影《雨人》的主角雷蒙或是韓劇《非常律師禹英禑》的禹英禑都令人印象深刻，不過天才或高智商的自閉症患者只是極少數，而且不同患者的症狀輕重差異很大，故稱之為「譜系」（spectrum）。

理解遺傳性疾病，可利用遺傳學與基因體學的研究方法，比較患者與非患者之間的遺傳差異，便有機會尋獲致病的遺傳成因。過往研究得知，有些遺傳性疾病只取決於單一或少數基因的強力影響，例如亨廷頓舞蹈症（Huntington’s disease）、纖維性囊腫（cystic fibrosis）等，致病原因較為單純。

自閉症自然也受到先天遺傳基因影響，然而，它涉及許多影響力不明顯的基因，而且影響每名患者的基因又不盡相同，讓遺傳與症狀的關係更加複雜。如果從 RNA 研究路徑出發呢？RNA 是核糖核酸，具有承載 DNA 訊息和調控基因等功能，相比於其他疾病，在 RNA 層次研究自閉症的另一挑戰是取樣極為困難，自閉症患者的病因位於大腦內部，通常無法直接從人腦取樣分析。所幸的是，若檢視去世者捐贈的大腦樣本，仍有機會一窺自閉症的腦內奧秘。

莊樹諄分析的數據來自公共存取的 Synapse 資料庫，包括上百位自閉症患者與非自閉症者的資料。人數乍看不多，卻已是當今想同時探討同一個人的基因體（DNA 層次）與轉錄體（RNA 層次）間因果關係的最佳的選擇。藉由此一資料庫蒐集的人類腦部組織轉錄體資料，可全面探討各式各樣的 RNA，包含信使 RNA（messenger RNA，簡稱 mRNA）、小分子 RNA（microRNA，簡稱 miRNA），以及莊樹諄鎖定的研究目標：環狀 RNA（circular RNA）。

不能轉譯，但似乎會互相影響？非編碼 RNA

莊樹諄的教育背景是資訊學博士，博士後研究的階段投入生物資訊學，之前主要從事 RNA 與靈長類演化方面的研究，探討多樣性切割、RNA 編輯（RNA editing）等議題，環狀 RNA 則是他近年來特別感興趣的題材。

根據生物資訊學的預測，環狀 RNA 這類長鍊的 RNA 分子有數萬個，但實際上有多少仍不清楚。它們在大腦神經系統特別常見，似乎涉及許多基因調控的工作。莊樹諄目前最關注環狀 RNA 對自閉症的影響，不過他指出這番思路不限於自閉症，阿茲海默症、帕金森氏症、精神分裂症（schizophrenia）等疾病也能用同樣的方法探索。

不過，什麼是環狀 RNA 呢？按照序列長度、作用，可以將 RNA 分為很多種類。DNA 轉錄出的 RNA 經過處理，有些形成 20 多個核苷酸長的短鏈 RNA，如 miRNA 屬於此類。一些較長鏈的 mRNA 又會轉譯成氨基酸，產生各式蛋白質。還有些長鍊的 RNA 不會轉譯，仍然維持長鍊 RNA 的形式發揮作用，統稱為長鍊非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA），莊樹諄研究的主角環狀 RNA 大致上被歸屬於一種非編碼 RNA。這麼多種類的 RNA 彼此會互相影響，導致複雜的基因調控。

由 DNA 轉錄而成的 RNA 是線形，至於「環狀」RNA 一如其名，是 RNA 長鏈首尾相接後形成的環形結構，相比線形 RNA 更加穩定，不容易遭到分解。這些長期存在的圈圈，假如序列可以和短鏈的 miRNA 互補，兩者便有機會結合在一起，讀者可以想像為類似「海綿」（sponge）的吸附作用。

miRNA 原本的工作是結合 mRNA，使其無法轉錄為蛋白質，抑制基因表現。可想而知，一旦 miRNA 被環狀 RNA 吸附，便無法再干擾 mRNA 作用，失去抑制基因表現的效果。因此環狀 RNA 能透過直接影響 miRNA，來間接參與調控其他的下游基因。這便是環狀 RNA 的許多種調控功能中，最常被研究的一種。

自閉症的成因要往腦部深究，環狀 RNA 又在腦部表現最多，使得莊樹諄好奇當中的奧秘。然而儘管如今 RNA 定序已經很發達，環狀 RNA 由於結構的關係，一般的 RNA 定序方法無法抓到這類環形分子。莊樹諄指出這也是 Synapse 資料庫的一大優點，此一資料庫罕見地包含能找出環狀 RNA 的 RNA 定序資料，配合 miRNA、mRNA 與基因體等資料交叉分析，才有機會闡明環狀 RNA 的角色。

尋找環狀 RNA 和自閉症的關聯

莊樹諄率領的團隊已經發表 2 篇環狀 RNA 與自閉症的研究論文，第一篇論文著重於尋找哪些環狀 RNA 和自閉症有關，研究假設是環狀 RNA 透過 miRNA 間接影響自閉症風險基因 mRNA 的表現。由於環狀 RNA、miRNA 和 mRNA 都多達數萬個，需要統計分析的幫忙。

首先，將樣本分為有自閉症／無自閉症。要注意每個自閉症患者的基因表現仍有差異，納入夠多樣本一起比較，才有機會看出端倪。

接著，尋找環狀 RNA 和風險基因有顯著相關的搭配組合。例如：高比例自閉症的人，某個環狀 RNA 含量較高時，某個風險基因的 mRNA 表達量也較高，那這組環狀 RNA 和基因就存在正相關；反之則為負相關。

不過相關性很可能只是巧合，所以莊樹諄團隊比對序列，找到符合上述相關性的中介因子「miRNA」。最後再觀察「當排除 miRNA 影響時，環狀 RNA 與風險基因的顯著關係即消失」的組合，這些消失的組合，就是真正共同參與基因調控的「三人組」（環狀 RNA、miRNA、mRNA）。

一番分析後，篩選出的環狀 RNA 共有 60 個，其中涉及與 miRNA、mRNA 的組合總共 8,170 組。人類一共 2 萬個基因，與自閉症有關的調控網路就有 8,000 組之多，數字相當可觀，顯示環狀 RNA 的重要性。莊樹諄用統計手法找出的自閉症風險基因，和過去科學家已知的部分風險基因相符合，未來可以繼續探究在這 8,000 組調控網路中，有哪幾組是真的作用在生物上。

在資訊與統計分析之外，莊樹諄的團隊也有人進行分子生物學實驗，驗證 RNA 調控網路的相互影響。以體外培養的人類細胞為材料，人為誘導遺傳突變，精確分析特定環狀 RNA 在細胞內分子層次的作用。實驗證實選取的環狀 RNA，確實會結合 miRNA，又影響 mRNA 的表現。

基因調控是什麼？

莊樹諄強調，使用資料庫的公開資料，好處是經過多方檢視，避免資料品質不一致的問題，缺點是大家都能取得數據，必須要跳脫既有的思考模式才能發現新的結果。他在環狀 RNA 議題的新思路，成為第二篇論文的內容：探討環狀 RNA 的遠端調控（trans-regulation）對自閉症的影響。

基因的表達會受到基因調控元件（regulatory element，一段非編碼 DNA 序列）的影響，若調控元件就在基因附近，稱為近端調控（cis-regulation）；如果調控元件不在附近，甚至位於另一條染色體上，則為遠端調控。

研究基因調控，通常近端比遠端調控容易，因為近端調控元件（cis-regulatory element）的位置就在基因旁邊，不難尋找；但遠端調控卻沒那麼直觀，作用機制也比較難以想像。實際上常常能發現一個基因的表現，受到多處近端調控，加上多處遠端調控的影響。如果想全方位認識一個基因的表現與調控，最好能都能得知近端與遠端的影響，否則難以掌握調控的全貌。

莊樹諄的想法是，某些基因被遠端調控的過程，是否有環狀 RNA 參與？具體說來就是某個調控位置，先近端調控其周圍的環狀 RNA 基因，再藉由環狀 RNA 影響基因體上其他位置的基因表現，發揮遠端調控的效果。

為了避免用語誤解，有必要先解釋一下什麼是「基因」。基因的概念隨著生物學發展持續改變，如今一般人熟悉的定義，基因是由 DNA 編碼序列構成，能轉錄出 mRNA，再轉譯為蛋白質的訊息載體。不過若將基因定義為會轉錄出 RNA 的 DNA 序列，那麼即使沒有對應的蛋白質產物，只要其衍生的 RNA 產物有所作用，也能視為「基因」，如 miRNA 基因、mRNA 或長鏈非編碼 RNA 基因。既然是有 DNA 編碼的基因，便會受到近端、遠端調控位置影響。

探索遠端調控機制有很多想法，莊樹諄可以說又打開了一條新思路。遠端調控位置不在基因旁邊，亦即基因體任何地方都有機會。假如直接挑戰基因與遠端調控位置的關聯性，可能相關的數量可謂天文數字，而且缺乏生物性的理由支持，找到的目標往往令人半信半疑。

莊樹諄引進環狀 RNA 涉及其中的可能性，尋找「環狀 RNA 基因的近端調控位置」與「目標基因的遠端調控」之交集，大幅縮小了搜索範圍。

一番分析後，研究團隊從自閉症患者的基因體上，定位出 3,619 個近端調控的 circQTLs，這些表達數量性狀基因座相當特殊，可能藉由直接或間接遠端調控兩種模式來調控遠端基因(如上圖)。而這 3,619 個 circQTLs，與環狀 RNA、遠端基因三者形成了八萬六千多組的遠端調控網路。接著團隊使用了不同的統計方法，其中 8,103 組通過多重統計測試，顯示較高的機率是屬於間接遠端調控模式。

莊樹諄團隊透過統計手法，找到相當多基因和調控路徑，雖然目前仍不清楚它們影響自閉症的具體細節，卻無疑讓我們新增一分對自閉症的認識。

莊樹諄指出，這套統計方法或可應用至人類的其他複雜疾病（如思覺失調症），找出基因調控的多個可能路徑，提供臨床醫藥研發更多線索。

生物與資訊的跨領域結合

訪談中問到：為何會從資訊科學跨入到生物領域？莊樹諄回憶，1998 他博士班畢業那年才第一次聽到「生物資訊」這個詞，他基於對生命科學的興趣，以及因為內在性格想往學術轉型的想法，引領他到了中研院。

莊樹諄接著說，2003 年李文雄院士延攬他進入基因體研究中心，之前他們不曾認識。他感謝李院士帶他進入了分子演化的世界，就此打開了研究視野。在剛開始成立自己的實驗室時，缺少人力，李院士讓當時的博後陳豐奇博士（現為國衛院群體健康科學研究所研究員兼任副所長）與他共同工作。莊樹諄強調，他所有分子演化的觀念與基礎，都是陳博士幫他建立的，如果說陳博士是他的師父，那李院士就是師父的師父了。

如今，莊樹諄在中研院的研究生涯邁入第 25 年，從資訊學背景投入生物學研究，大量使用統計工具，他經常需要持續整合不同領域的觀念與工具，推動自己的新研究。在訪談中，他也感謝諸多研究同儕的協助，特別是幾年前建立分生實驗室時，蕭宏昇研究員及其團隊成員的鼎力相助。

莊樹諄的團隊包含資訊、統計、分子生物三個領域的同仁，來自不同領域，傾聽他人意見自然也特別重要，這是他們實驗室的核心價值之一。莊樹諄認為在科學面前，人是很渺小的，需要互相尊重和理解，方能一起解開科學之謎。

最後，莊樹諄特別強調他個人在相關領域的研究，仍有極巨大的進步空間，感謝研之有物的主動邀訪，期望將來能與更多先進交流學習，也企盼年輕新血加入這個生物資訊的跨領域團隊。

愛犬慘死，兇手逍遙法外。縱然不是每個人都如電影《捍衛任務》的 Johon Wick，身懷絕技，謀求私刑正義；^[1]透過科學管道，至少可以討個答案，獲得心靈平靜。義大利某隻母的傑克羅素㹴（Jack Russell Terrier），橫屍寵物旅館的院子，得年 8 歲。犬舍的網子破裂，有向內拉扯的痕跡。寵物旅館老闆養的3隻荷花瓦特犬（Hovawart），嫌疑重大；然而事後到場的獸醫，卻認為野生狐狸或海狸才是罪魁禍首。傑克羅素㹴的主人心有不甘，遂找上波隆那的一所動物疾病預防研究機構（L’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia-Romagna）。^[2]

解剖狗屍

這隻傑克羅素㹴死後，在日均溫 7 °C 的環境，被擱置 18 到 20 個鐘頭。接著於 − 18 °C 的冰庫裡，凍了 1 個月，才被研究機構拖出來驗屍。從外觀看來，牠生前的健康狀況良好。不過，毛皮沾血，且有 14 道 7 至 10 公厘，略呈橢圓，邊緣清楚的咬傷，分佈於頸、肩、胸、肋弓、大腿（照片）和鼠蹊。另外，腰部還有個 10 公分長，2.5 公分寬的大傷口。剝掉狗皮後，可見創傷頗深：左邊頸、胸的肌肉浸潤於血中；胸腔與腹腔內，也有輕微出血；肋間肌、肋膜及腹壁穿孔；並有一根肋骨骨折。綜合以上，牠顯然死於咬傷穿透胸部，^[2]使空氣在肋膜腔中累積而壓迫肺臟，^[3]所導致的氣胸（pneumothorax）。^[2]那麼究竟是什麼動物如此殘暴？

nDNA vs. mtDNA

兇手遺留在死者身上的 DNA，是指認身份的好線索。^[2]細胞中的細胞核（nucleus）和粒線體（mitochondria）都含有 DNA，^[4]分別簡稱為 nDNA 與 mtDNA，兩者並不相同。以人類為例，前者包含從雙親得來的 2 至 3 萬個基因；後者則有 37 個，主要遺傳自母親。^[5]分析 nDNA 的短縱列重複序列（short tandem repeat；STR），也就是一些鑑別度高的小片段；^[4]或是單核苷酸多型性（single nucleotide polymorphism；SNP），即DNA序列中單一鹼基的變異，^[6]便能辨識個體。^[2]

以此案來說，最理想的作法，當然是從㹴犬身上的咬傷取樣，分析 nDNA，再比對兇嫌的樣本。可惜屍體於運送的過程中，大概已經受到汙染，驗了也未必準確。再加上寵物旅館的老闆，絕不可能讓3隻荷花瓦特犬配合調查，這個辦案方向根本毫無希望。^[2]

好在天無絕人之路，數根 5 到 10 公分不等，顏色有深有淺的毛髮，不僅卡在死者的牙縫裡（照片），還纏於腳掌上。它們出現的位置奇怪，長得又跟梗犬的不同，或許正是來自兇手。儘管鑑識採集的毛髮時常不帶毛囊，^[2]而髮幹的 nDNA 含量又極低，不過會有相當充足的 mtDNA，^[7]可以辨識物種。於是，鑑識人員挑了最長又最完整的 4 根送驗。^[2]

狼 vs. 犬

毛髮 mtDNA 分析的結果，顯示其來源非狼即犬，才不是獸醫瞎說的狐狸或海狸。如果進一步由傷口位置，回推攻擊方式，嫌疑範圍又會縮得更小：^[2]

狼（Canis lupus）作為掠食者，攻擊講求效率。最好不太耗費能量，便獵得豐美肉食。特別是遇到傑克羅素㹴，這種小型犬的時候，會朝頸部直接咬死，然後狼吞虎嚥。此外，該寵物旅館附近，沒有狼出沒。^[2]

相對地，狗（Canis lupus familiaris）打起架來，才會全身從頭到尾胡亂咬。好不容易把對方搞癱了，卻放著全屍一口沒吃。因此，本案的兇手應該是中、大型犬，而且當時有機會與死者接觸的，唯有那 3 隻毛髮長度和顏色，與證物完全吻合的荷花瓦特犬。^[2]

身後貢獻

鑑識團隊完成狗主人託付的任務後，撰文介紹將 mtDNA 的細胞色素 b 基因（cytochrome b gene），放大並定序，最後確認物種的細節。^[2]雖然不曉得他們的努力，是否有助司法公道，但是好歹已為學術研究貢獻心力。天下蒼生多少默默無聞，死後被立碑著傳的又有幾個？一隻備受寵愛的傑克羅素㹴，能榮登學術期刊，也算不枉此生。

參考資料

1. ‘John Wick’. IMDb. (Accessed on 02 AUG 2023)
2. Roccaro M, Bini C, Fais P, et al. (2021) ‘Who killed my dog? Use of forensic genetics to investigate an enigmatic case’. International Journal of Legal Medicine, 135, 387–392.
3. McKnight CL, Burns B. (15 FEB 2023) ‘Pneumothorax’. In: StatPearls. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing.
4. Department of Emergency Services and Public Protection. ‘Nuclear DNA’. U.S. Connecticut’s Official State Website. (Accessed on 01 AUG 2023)
5. Storen R, Smith E. (11 JUN 2021) ‘Mitochondrial donation in Australia.’ FlagPost by Parliament of Australia.
6. Gunter C. (01 AUG 2023) ‘Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)’. U.S. National Human Genome Research Institute.
7. Tridico SR, Koch S, Michaud A, et al. (2014) ‘Interpreting biological degradative processes acting on mammalian hair in the living and the dead: which ones are taphonomic?’. Proceedings of the Royal Society B, 2812014175520141755.

本文轉載自中央研究院「研之有物」，為「中研院廣告」

• 採訪撰文／寒波
• 責任編輯／簡克志
• 美術設計／蔡宛潔

80 歲高壽的分子演化學家

您知道中央研究院有位相當低調的遺傳演化學大師嗎？此人開創了許多分子演化的數學分析方法，他就是生物多樣性研究中心的特聘研究員李文雄院士！數學是李文雄用來描述生物演化的工具，用 DNA 序列計算分子時鐘是他的重要貢獻。至今 80 歲高壽的李院士，是國內唯一獲得巴仁獎榮譽的得主，不僅培育眾多學生，並且依然在最前線探索未知。中研院「研之有物」專訪李文雄，邀請他分享在美國與臺灣的學研經歷及主要研究成果。

用數學在演化生物學領域開疆拓土

李文雄身為世界首屈一指的分子演化學家，也是經典教科書的作者，學分子演化的人肯定讀過他的書或論文。不過讓年輕學子們驚訝的是他大學就讀的科系，其實和生物及數學沒有直接關係，而是中原理工學院（中原大學前身）土木系。

李文雄表示，當年資訊閉塞，他像同學一樣照著聯考分數填志願，就這麼進了土木系。讀到大二接觸專業科目後，確認土木不是想要念的學門，便考慮投入數學或物理領域，又以數學比較得心應手。可惜他沒有考上數學碩士班，倒是考進了中央大學地球物理研究所。拿到碩士之後，李文雄更加確定比起物理，自己更適合念數學。

早年臺灣的進修資源很有限，李文雄選擇赴美深造，就讀布朗大學的應用數學博士班。當構思論文題目時，他想要找一個還沒有人用數學深入探討的領域，以便發揮所長。那時日本出身的遺傳學家根井正利（Masatoshi Nei）正好轉到布朗大學生物系授業，李文雄與他討論後，決定帶著數學專長投入尚待開拓的生物學，就此開啟 50 年輝煌的研究生涯。

李文雄在博士班前的求學之路，可以說比其他人多走了好幾步，但也練就了深思熟慮的精準眼光，「Make right choice!」是他學到最重要的能力。用數學來探討生物學，即為他一生最好的抉擇之一。

轉換跑道到生物學，李文雄幾乎沒有遇到太多困難，即使他是在博二暑假才開始學遺傳學，但數學好的人在群體遺傳學領域有些優勢，他受到師長賞識，只花費兩年就完成博士論文，再經歷一年威斯康辛大學麥迪遜分校的博士後研究，1973 年李文雄便前往德州大學休斯頓分校擔任助理教授，因為恩師根井正利在一年前已搬去那裏。

「分子演化」探討微觀的生物演變

分子演化（molecular evolution）和我們一般認知的演化有什麼不同？生物以 DNA 承載遺傳訊息，基因又會產生蛋白質。分子演化學簡單說來，是以 DNA、蛋白質這類遺傳資訊探討生物隨時間演變的學問。

分子演化學在 1960、1970 年代，木村資生（Kimura Motoo）、威爾森（Allan Wilson）等前輩主要是以蛋白質序列作材料，由於蛋白質定序很慢成本也高，李文雄並沒有跟風投入研究。直到後來桑格（Sanger）的 DNA 定序方法 1977 年問世後，陸續有 DNA 資料發表，李文雄認為時機已到，便全心擁抱分子演化學的新天地，大獲成功，成為引領潮流的先驅者。

李文雄開始研究分子演化時已經有電腦，但當時還是卡片打孔的時代，計算過程相當繁複，不像現在有各種套裝軟體可以做數學統計分析。值得一提的是，今日相當受歡迎的分析軟體「MEGA」（Molecular Evolutionary Genetics Analysis），便是恩師根井正利與弟子們一起開發而成的。

在詳細講分子演化之前，我們還是先來複習一下遺傳學吧！

基因編碼以三個核苷酸為一組密碼子，並對應一個氨基酸（蛋白質的基本單位）。DNA 有 A、T、C、G 四種核苷酸，可以形成 64 種組合，而氨基酸只有 20 種，所以有些氨基酸對應兩種以上密碼子。

因此改變 DNA 的核苷酸，有時候不會改變氨基酸，此時稱為同義突變（synonymous mutation）；有時候會改變氨基酸，此時稱為非同義突變（nonsynonymous mutation）。比較 DNA 序列和胺基酸序列變與不變之比例，就能大約估計天擇力量的影響，推測天擇是傾向去除突變還是選擇突變。這是分子演化常見的分析之一，李文雄的實驗室開發了數個被廣泛應用的分析方法。

在分子演化興起前，不同生物間的親疏關係，可以透過生物形態的相似程度建構演化樹，但形態資料很有限。比較生物 DNA 或蛋白質的資料，可以細緻地釐清物種間的親緣關係，對分類學的貢獻很大。

比方說早期演化學家會比較一群鳥類的嘴喙特徵，兩種鳥喙的形態差異較小，便代表其親緣關係較近；而分子演化學家則是比較這群鳥類的 DNA 或蛋白質序列的差異，更能釐清彼此的親緣關係。

形態是巨觀的，分子是微觀的。但我們也可以說每一處 DNA 或氨基酸位置都相當於一種形態。分子資料通常更容易取得，可提供比較的特徵數量也比形態還多很多，更容易計算。

現今探討親緣關係，最好能考慮不同材料，有多重證據的支持，因此分子演化的分析方法就相當重要。李文雄在親緣樹建構及統計評估的方法上有重要貢獻。

李文雄回憶，他的好朋友古德曼（Morris Goodman）當初便靠著分子生物學的方法，釐清人類和黑猩猩（chimpanzee）的遺傳親緣關係，要比和大猩猩（gorilla）更近，解決了爭議了數十年的「大猩猩—黑猩猩—人類的三角問題」，是一大貢獻。

大師傳承的軌跡：中性演化和分子時鐘

今日分子演化之所以和 50 年前有很大差別，其中就有來自李文雄的重要貢獻。李文雄建立了數學方法讓「分子時鐘」（molecular clock）理論得以實際應用至生物演化的分析。

分子時鐘的概念是：DNA（或蛋白質）序列的演化以等速進行。如果這個假設成立，則透過兩個物種之間 DNA 序列的差異，就可以估計分化的時間。也就是以分子的變化量為時鐘來計算這兩個物種分離後時間的流逝。

之所以可以這樣假設的基礎，是生物在一代代傳承下，由於突變之故，遺傳序列不斷累積新的變化，稱為「取代」（substitution）；而取代的數量正比於世代數，例如每一代新增 5 處取代，差異 50 處便可回推經過 10 代。

然而，這假設與傳統達爾文的天擇概念有很大的出入；因為分子時鐘這樣假設的意思就是說：大部分突變不會影響天擇，對生存競爭的影響可謂中性（neutral）。上述觀點也就是根井正利和李文雄的前輩：木村資生提出的「中性演化理論」。

木村資生認為，大多數遺傳分子的改變未必和天擇有關，個體間的遺傳多樣性往往是隨機變化的結果。當初這個論點引發很大爭議，後來又經過許多改版與補充，如今中性演化的觀點已被許多學者接受，分子層次的遺傳變異，常常不影響其天擇；新突變取代舊的遺傳訊息，未必是因為其有利於生存競爭，也常常只是運氣好而已。

中性演化理論提供了分子時鐘的理論基礎，帶來許多突破。例如受到注目的智人（Homo sapiens）起源問題，於 1980 年代根據各地人群間的遺傳差異程度，判斷歐亞人與非洲人分家只有數萬年，而非多地智人起源論主張的上百萬年，這便是「單地起源，智人出非洲說」的有力證據。

李文雄自己在 2000 年代初期也指導博士生陳豐奇（現職為臺灣國家衛生研究院的研究員），比較人類與人猿非編碼區的 DNA 序列，便估計出人類與黑猩猩分家約 600-700 萬年。

李文雄在 1980 年代的一關鍵貢獻就是，率先用 DNA 序列評估分子時鐘的正確性，發現取代的速度並非等速。他證明分子時鐘運行的速度和世代長短有關：世代愈短，時鐘愈快。例如大鼠、小鼠的世代比人類的世代短得多，而牠們之間演化的速度，也是人類與人猿間的大約 5 倍。此一發現有助於更準確地估計兩個物種間的分家時間。

李文雄另一重大發現是，同一物種的兩性之間，生殖細胞的突變速度可能不一樣，男比女快。這在生物學上的理由是：生殖細胞的複製及分裂次數不同。女生的卵在出生前便已儲備好了，而男生的精子則是一輩子持續複製，所以男生生殖細胞的突變速率比女生快。

關於同一物種的性別演化差異，李文雄表示這是前輩霍爾丹（J. B. S. Haldane）提出的觀點。李文雄設計好 DNA 定序區間及物種，產生適合材料，於是就驗證了此假說。雖然講起來雲淡風輕，但若讀者了解遺傳學發展史應該會深受震撼，因為霍爾丹正是奠定族群遺傳學的三大名家之一，從霍爾丹到李文雄，我們可以看見大師傳承的軌跡。

遺傳與演化學最高榮譽：巴仁獎

靠著數學和分子生物學的分析，李文雄解決了許多演化生物學的難題。比如，他在 1991 年就以很有限的人類 DNA 序列資料，預估人類的 DNA 多樣性低於 0.1%，比果蠅的低不少，十年後大量的資料證明他的預估是正確的！還有，在 2001 年當黑猩猩的基因體資料還很有限時，他就預估出人類與黑猩猩的基因體相差只有 1.2%，這個預估引起很大的震撼，因為人類與黑猩猩看起來很不一樣，但當黑猩猩的基因體於 2005 年發表時，得到的答案與李文雄的預估完全一樣！

承上，李文雄陸續受到各界肯定，他於 1998 年被挖角到芝加哥大學擔任 George Beadle 講座教授（Beadle 為一位諾貝爾獎得主），並當選中研院院士。2003 年更獲得兩項重大榮譽：美國國家科學院院士和巴仁獎（Balzan Prize for Genetics and Evolution）。

要成為美國國家科學院的院士並不容易，對學者而言是極大的榮譽。例如：以中研院為例，最近的三任院長廖俊智、翁啟惠、李遠哲；以及超導物理學家吳茂昆、公衛學家陳建仁、經濟學家朱敬一、植物學家蔡宜芳等，每一位都是該領域世界級科學家。

獲頒巴仁獎則更為難得，李文雄是史上第三位得獎的遺傳與演化學家，也是第一位亞洲出身的巴仁獎得主。巴仁獎從 1978 年以來獎勵人文、哲學、物理科學、生物科學，或促進和平的傑出人士或組織。對演化學家來說，巴仁獎就是遺傳與演化學的最高榮譽。

李文雄獲得巴仁獎時的引文如下：

「李文雄對分子演化做出了許多基礎性的貢獻。他開發並應用了數學技術來解決非常廣泛的問題，他的方法是屬於該領域最常用的方法。

隨著 1980 年代以來 DNA 序列數據的爆炸式增長，李文雄一直是通過比較 DNA 序列來推斷演化關係的方法的設計師。他在建立估計演化樹的準確程度和可以放在其中的統計置信度的方法方面特別有影響力。

以往解釋 DNA 數據的一個關鍵假設是 DNA序列的變化在演化時間上以恆定速率進行（所謂的分子時鐘）。該假設常被用於估算譜系分歧的時間。1980 年代，李文雄第一個證明分子時鐘的運行速度取決於世代的長短：世代越短，時鐘越快。因此，時鐘在大鼠和小鼠之間的演化速度是猴子和人類之間的演化速度的五倍。這一發現有助於更好地估計兩物種的分歧時間。

李文雄在證明 DNA的突變率在男性生殖細胞高於女性生殖細胞的工作也很有影響力。他已經在包括人類在內的高等靈長類動物以及囓齒動物證明了這一點。

除了開創性研究外，李文雄還在分子演化領域的教育上 扮演一核心人物。他的書被認為是該領域的權威。」

在獲得巴仁獎的遺傳及演化學家之中，第一位為 1984 年得獎的萊特（Sewall Wright，美國人），與前述提及的霍爾丹，同為族群遺傳學三大開創者之一；第二位則是 1991 年英國的梅納德史密斯（John Maynard Smith），再來就是 2003 年的李文雄。生物科學包含那麼多領域，遺傳及演化大約十年才得獎一次，讓李文雄覺得這項肯定十分難得。

李文雄的成就受到芝加哥大學的肯定，在 2004 年為他設立 James Watson 講座教授（Watson 以雙螺旋 DNA 模型得諾貝爾獎，是一家喻戶曉的名字），並提供研究資源。然而，過了四年之後，李文雄決定回到臺灣，提攜後進。

回歸臺灣，培育後進

2008 年，李文雄終於回到這塊多年成長的土地，擔任中研院生物多樣性研究中心的主任。除了自己的研究外，他特別重視兩件事：首先是和臺灣師範大學合辦「生物多樣性國際研究生博士學位學程」，在臺灣本土培育新生代的研究人員。

再來他號召成立「臺灣演化與計算生物學會」，成立的初衷是因為李文雄覺得臺灣研究演化的人不多，希望讓演化、生物資訊領域的人集中起來交流，尤其是讓年輕的研究者有練習發表的舞台，增加被認識的機會。擔任兩屆理事長後，李文雄交棒給臺灣大學的丁照棣教授，以及陽明交通大學的黃宣誠教授。

學會在李文雄奠定的基礎上持續前進，2012 年開始年年舉辦國際研討會，除了邀請外國學者參加，也會特別安排新進學者演講的場次，至於博士生、博士後，則設有專屬的口說與壁報比賽。另外為了兼善臺灣各地，年會舉辦的地點一年在臺北，另一年在臺北以外輪流，包括高雄、臺南、臺中、苗栗等地，展現兼顧不同區域的用心。

李文雄也鼓勵大家，多參加不同的研討會與加入學會。獲取新知對做研究的人相當重要，參加活動多看多聽多交流，都是寶貴的機會，不只能增加知識，有時候也能獲得他人幫助，有助於自己的研究。

回到臺灣以後，李文雄除了指導學生，本人依然站在研究的第一線，而且兼顧學術與應用的方向，合作對象眾多，議題包括鳥類羽毛的發育演化、微生物固氮作用的起源與演化，還有開發 C4 水稻（水稻是 C3 植物，希望能改造為光合效率更好的 C4 型態）等等。

近期值得一提的是，李文雄與合作團隊發表在分子演化頂級期刊《Molecular Biology and Evolution》的研究。他們探討新冠病毒棘蛋白（spike protein）的受體蛋白 ACE2 的演化，發現一些非人類的靈長類動物，有大量降低親和力的 ACE2 突變，讓這些猴子的 ACE2 不容易和病毒的棘蛋白結合，因此對病毒有很強的抵抗力。又發現有少數人的 ACE2 也帶有會抵抗病毒的突變。李文雄也說，如果人類與舊世界猴子的共同祖先的 ACE2 沒有突變成與棘蛋白更容易結合的話，也許新冠病毒就不會造成全球大流行，或是病毒的危害不至於那麼廣、那麼深！

勇於追求「跨領域」研究，尋找新鮮的問題

李文雄入行 50 餘年一直活躍在第一線，作為參與者和見證人，最有資格回答「分子演化學在過去和現在有什麼不同？」。他表示，以前容易找到重要的題目，但是取得資料的速度很慢。現在隨著分子生物學及資訊科學技術的進步，比較容易取得大量資料，資料多就容易找到題目，寫論文不難，內容也會比較豐富。可是期刊的要求也變高，而且比較不容易找到新鮮的議題，如今剩下的題目，多半是舊題目的延伸，或是難度很高。還好，現在科技發展迅速，目前的難題也許在不久的將來，就可以解決！

李文雄還是如年輕時一般，善於尋覓突破機會。像是微生物的固氮作用，無疑是重要的問題，氮是所有生物的必要元素，但只有非常少數的微生物可以固氮！可是從前卻少有演化學者研究這個問題，這就會成為好的題材。

另一方面隨著技術進步，以前難如登天的問題，現在也可能有機會解答。上面提到人類與黑猩猩的 DNA 分歧只有 1.2%，但兩者間的差異除了非編碼區外，也有很多來自基因調控不同的區域，尤其是腦部發育。過去這幾乎是不可能探索的議題，如今難度雖大，卻是有希望解決的難題。總之，在李文雄的視角中，一直都有新鮮的問題。

科學隨著歲月累積，現在入行的新人，必須先具備的知識遠超過李文雄當年，必須勇於追求「跨領域」研究。李文雄建議大家，不論時代如何改變，都要確認自己的喜好與專長，才能有計劃地學習和投入。李文雄以自己為例，他不會做實驗，但為了解決他很感興趣的生物問題，他設立一分子生物學實驗室，拿到了很多實驗資料，進而解決了不少演化難題！

讓李文雄院士印象最深刻的研究是⋯⋯

演化生物學時常有驚奇的新發現。身為世界級的演化大師，李文雄漫長的研究生涯中，對哪件科學發現的印象最深刻呢？

答案十分有趣，竟然是「河馬是鯨魚和海豚最親近的親戚」！

鯨魚、海豚是由陸地回到海洋生活的哺乳類，很難想像牠們在演化樹上的位置很相近。然而，透過 DNA 分子的比對，演化學者發現在現存動物中，鯨豚最接近偶蹄目的河馬。

此外，李文雄認為黑猩猩與人類的差異也相當有趣！威爾森（Allan Wilson）在 1970 年代發現黑猩猩與人類的蛋白序列幾乎相同，雖然它們在外觀與行為上有很大的不同，所以威爾森認為基因調控的演化是造成黑猩猩與人類有不同外觀和行為的主要原因，但到底是哪些基因調控上的不同，至今還是個謎！

最後，李文雄對非洲維多利亞湖（Lake Victoria）慈鯛魚（cichlids）的大量種化現象，也感到非常的奧妙，為什麼在同一個湖泊裡可以演化出這麼多慈鯛魚物種呢？！

投身科學研究 50 多年，取得一項又一項重大成果，李文雄依然由衷保持對新知識的好奇與樂趣。

延伸閱讀

• 中研院生物多樣性研究中心。〈尋找會對抗新冠病毒的人類及其他靈長類的ACE2突變〉。
• 李名揚（2008）。〈從數學出發的生物學大師──巴仁獎得主李文雄〉，《科學人》。
• 涂世宗、邱燕淇（2005）。〈李文雄〉，《十年有成—中大菁英名人錄》。
• Kyoto Prize. (2014). Message from Dr. Masatoshi Nei -The 2013 Kyoto Prize Laureate
• McGowen, M. R., Tsagkogeorga, G., Álvarez-Carretero, S., Dos Reis, M., Struebig, M., Deaville, R., . . . Rossiter, S. J. (2019). Phylogenomic resolution of the Cetacean Tree of life using target sequence capture. Systematic Biology, 69(3), 479-501. 
• Shedlock, A.M. and Okada, N. (2000), SINE insertions: powerful tools for molecular systematics. Bioessays, 22: 148-160.
• The Pennsylvania State University. (2015). Kyoto Prize awarded to Penn State’s Masatoshi Nei
• Tsagkogeorga, G., McGowen, M. R., Davies, K. T. J., Jarman, S., Polanowski, A., Bertelsen, M. F., & Rossiter, S. J. (2015). A phylogenomic analysis of the role and timing of molecular adaptation in the aquatic transition of cetartiodactyl mammals. Royal Society Open Science, 2(9), 150156. 
• University of California Museum of Paleontology. Molecular clocks. Understanding Evolution.