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灑下百道層光,一窺微觀世界的生命律動:「晶格層光顯微鏡」如何為細胞拍攝寫真集

  • 採訪編輯|廖英凱 美術編輯|張語辰

為活細胞拍微影像

中研院應用科學研究中心的陳壁彰助研究員,與團隊利用「空間光調變器」開發了「晶格層光顯微鏡」,具有高解析度、長時間觀測、低光毒性的特性,改革了活體螢光顯微術,使研究者能親眼目睹例如細胞分裂等活體生命現象。

陳壁彰團隊成員,與晶格層光顯微鏡。攝影/廖英凱

那些年,科學家如何「小」看世界

十七世紀起,Robert Hooke 與 Antoni van Leeuwenhoek 提出了顯微鏡的技術發展與改進,成為了微觀尺度生物學的關鍵基礎。隨著顯微鏡的改良與倍率的提升,我們也越來越了解微觀世界的樣貌。一沙一世界的美麗境界,就隨著一片片精心磨製的玻璃鏡片,向科學家敞開了偉大的航道。

然而,到了十九世紀後期,科學家開始察覺到:顯微鏡似乎無法隨著技術的進展,而使倍率不斷地放大。

圖/pixabay

Ernst Abbe 發現,這是由於光的波動性造成的干涉與繞射,導致顯微鏡所能得到的最小解析度,僅能是二分之一個用來觀測的光的波長。例如,如果利用波長是 500 奈米的黃光來觀測,所能得到的解析度就僅能有 250 奈米,雖還能看到細胞與細菌,但卻無法看清楚細胞內各胞器的樣貌。這一個波長的限制,也就是所謂的「繞射極限」。

為了突破繞射極限的阻礙,各種截然不同的思維與原理,催生了不依靠「可見光」來觀測微觀世界的顯微術,包含:利用觀測「電子」來顯示物體內結構、或表面樣貌的電子顯微鏡;利用原子間「凡得瓦力」的作用,來呈現物質表面樣貌的原子力探針顯微鏡;或利用近場光學的方式,將光源與樣品接近到只有數十個奈米,使距離拉遠時,光學的干涉與繞射現象無法顯現出來。

但多數相關觀測技術,都需在相當限制的條件,例如真空環境、極薄的樣品切片等才得以進行,對於活體生物的觀察仍受到諸多限制。

直至近二十年來,各種「螢光顯微術」的發展,使觀測微觀活體生物世界,有了嶄新的研究方式。

由於生物細胞的胞器或生物分子等,並不盡然有顯著的顏色差異,因此不能單純僅依靠可見光與倍率放大來觀察;因此,螢光顯微術的核心原理是將外加的「螢光分子」,附著或接合在指定的生物分子上,如特定的蛋白質或特定的脂質等。由於這些特定的生物分子的分布,會與生物細胞內的結構有關,所以藉由觀察螢光的分布,我們就能了解生物細胞的微觀結構。

2014 年,由 Eric BetzigStefan W. Hell 和 William Esco Moerner 等人榮獲的諾貝爾化學獎,其重要性就是利用了螢光分子的化學特性,繞過了物理上繞射極限的阻礙,而達到超高解析度的生物影像。

如何看得小又快、久又深

但是,儘管有超高解析度的影像,並不盡然能表現出活體生物裡的動態樣貌。現有螢光技術中,常利用汞燈與雷射來激發螢光分子,但這些激發的能量,往往使螢光能顯現的時間非常短,激發光的能量也會對生物分子造成傷害,也就是所謂的「光毒性」。

然而,若能夠延長觀測的時間與增加激發能量,則又可以觀測到活體生物的動態表現、與更細緻的現象;此外,多數超高解析度的顯微技術,都侷限在空間解析度的強化,而無法看到活體生物的立體結構與變化。

這些面向導致螢光顯微術的發展,總是在這四個維度之中拉鋸取捨:看得小(空間解析度)、看得快(時間解析度)、看得久(光毒性)與看得深(影像深度)。

光子預算 (photon budget) 的四個維度。活體生物影像總是在看得小、看得快、看得久與看得深,這四個維度中拉鋸取捨。資料來源/陳壁彰提供、圖說重製/廖英凱、張語辰。

為了實踐活體生物分子的螢光顯微觀測,中研院陳壁彰助研究員師承 Eric Betzig ,與團隊研發出「晶格層光顯微術」,讓光源只精準地照射到生物樣品中所要觀察的焦平面上,這樣的照明方式,可以減少不必要的照明以減少光毒性,又因只照明到待觀測的切面上,而能有效減少背景雜光。

如下圖,傳統的螢光顯微術中,照明的光源是與觀測視角同向的寬場光源 (widefield),使得觀測樣本整體都接受到激發光的能量,所要觀測的焦平面上下範圍,也因會被光源照射到,而產生背景雜光影響觀測品質。

為了解決寬場光源這樣過度照明的缺點,另一種「共軛焦顯微術」是利用針孔 (pin-hole),讓焦平面上的光源僅聚焦在極小的區域,但極小的焦平面上下的區域,仍然會被光照到而產生雜光。

螢光顯微術的這兩種照明方式,樣品的背景區域皆會被光照到,而產生雜光。
資料來源│陳壁彰提供 圖說重製│廖英凱、張語辰

如下圖,另一種傳統平面層光照明的方式,則是將照明的方向與物鏡觀測的方向垂直(正交),使被照明的區域可以籠罩待觀測的焦平面,但這樣的照明區塊仍然太厚。

對於以上的問題,利用「貝索層光照明」的方式,可以有效地改善。因為貝索光束能在焦平面上形成一條寬度僅有 0.5 𝝁m 的光束,使照明的光源僅照射到待觀察的焦平面上,讓影像擁有極佳的光學切面效果;再利用與光束垂直的觀測物鏡,以寬場成像的方式收集螢光。因此,只要在樣本中移動貝索光束,就能逐條觀測出待測樣品的微觀樣貌。

傳統平面層光照明,雖試著將光線聚焦於焦平面,然而其減少雜光的效果,還是不若貝索層光照明好。
資料來源│陳壁彰提供 圖說重製│廖英凱、張語辰

貝索層光照明動態示意:從X軸方向,利用單一貝索層光(藍線)掃描樣品(灰色塊),獲得切面(白色塊)。
資料來源│陳壁彰提供 圖說重製│廖英凱、張語辰

貝索層光照明動態示意:透過上下移動樣品,就能觀察到到不同深度的樣品切面。
資料來源│陳壁彰提供 圖說重製│廖英凱

用液晶螢幕圖形,製造出數百條層光

但是對於活體生物來說,僅依賴一條貝索層光掃描,仍無法精準且即時地觀測到生物體內的動態現象。因此,陳壁彰團隊應用了「構造化照明顯微術」(Structured Illumination Microscopy, SIM)的思維,先利用一個二維的光學晶格,來侷限光的延展方向,而輸出一層光;再利用自行開發的「空間光調變器」(Spatial Light Modulator, SLM),控制晶格紋路的呈現圖形。

陳壁彰團隊利用「空間光調變器」,可操控液晶螢幕上的圖形,讓雷射光穿過、製造出數百條貝索層光。
攝影│廖英凱 圖說重製│張語辰

空間光調變器,是一個由程式控制的液晶螢幕,螢幕上顯示了由理論計算出來的相位圖案,當入射的雷射光打到這個螢幕上的圖案時,如同透過一個光柵,使雷射光產生繞射、生成數百條的層光。利用數百條貝索層光同時掃描樣品時,僅需要「抖動」一下樣品,就能完成一次完整的掃瞄。

此外,由於可利用程式控制液晶螢幕上的相位圖案,因此研究者不會像傳統光學實驗一般,被所能取得的光柵元件特性侷限,而能精細且多樣化地微調出理想的層光狀況。

比起使用「單一貝索層光」來逐行掃描,陳壁彰團隊的方法不僅能維持良好的空間解析度,更因「數百條貝索層光」能快速完成掃描樣品的特性,而讓觀測結果有良好的時間解析度。再者,也能因精準地使用較低能量的光束,而維持低光毒性,來對活體樣本(例如細胞)進行長時間的追蹤觀測。

利用數百條貝索層光(藍線)掃描樣品(灰色塊)時,僅需要些微「抖動」樣品,就能完成一次完整的切面掃描(白色塊)。
資料來源│陳壁彰提供 圖說重製│廖英凱、張語辰

為活細胞拍微影像

晶格層光顯微鏡「良好時空解析度」與「低光毒性」的特性,可以讓研究者長時間觀測微觀生物世界的動態現象,例如:特別針對追蹤細胞內單分子的動態,來理解生物體內某些反應機制;或如下方影片動態,利用每秒一次的頻率完整掃描細胞,錄製長達十分鐘的影像,從而觀察到細胞分裂的完整流程與細節。

晶格層光顯微鏡的問世,引起眾多生物實驗室的高度興趣,特別是陳壁彰博士後時期的老師 Eric Betzig 非常強調顯微鏡的開發,一定要有生物學的「應用」!

因此,當晶格層光顯微鏡的第一版建置完成後,當時 Eric Betzig 特別要求陳壁彰租車開了 10 多個小時,將顯微鏡整組打包、載到一個研究烏賊神經網路的暑期工作營隊中,將晶格層光顯微鏡介紹給其他研究社群,並陸續在一年內與 37 個不同生物實驗室合作,觀測了各式各樣的生物樣本。除了能快速累積實驗資料以改善顯微鏡,也開啟廣泛接觸到不同研究主題的契機。

左圖為陳壁彰團隊運用晶格層光照射的海拉細胞二維影像,右圖是一般貝索光束。可以見到晶格層光能取得較細緻的結構成像。
資料來源│Chen, B. C., Legant, W. R., Wang, K., Shao, L., Milkie, D. E., Davidson, M. W., … & English, B. P. (2014). Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science, 346(6208), 1257998.

目前,晶格層光顯微鏡已從它眾多的觀測成果,被驗證為觀測活體生物的利器。然而晶格層光顯微鏡在面對深度較深的樣品時,仍會因為樣品本身的像差,而影響成像能力。且生物體中仍有太多不透明物質,會嚴重阻礙活體生物的觀察。

2014 年回到臺灣後,陳壁彰在中研院擁有自己的實驗室,陳壁彰認為,未來的研究方向,除了引進在天文觀測中,用以抵銷大氣影響的自適應光學 (adaptive optics) 概念以外,也須開發出對應的樣品製備方式,例如利用化學方法將脂質替換掉,使樣品透明化以便於顯微觀測。

相較於多數生物學界慣行的研究方法,「活體生物顯微術」的概念仍相當新穎,其中對於活體的定義、樣品的製備方式、與之對應的研究方法設計,都尚有研發與推廣的空間。但無庸置疑的是,晶格層光顯微鏡的問世,已為觀測微觀世界的生命律動,灑下了百道一窺堂奧的洞察之光。

延伸閱讀

本著作由研之有物製作,原文為《灑下百道層光,一窺微觀世界的生命律動──晶格層光顯微鏡》以創用CC 姓名標示–非商業性–禁止改作 4.0 國際 授權條款釋出。

 

本文轉載自中央研究院研之有物,泛科學為宣傳推廣執行單位


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關於作者

研之有物│中央研究院

研之有物,取諧音自「言之有物」,出處為《周易·家人》:「君子以言有物而行有恆」。探索具體研究案例、直擊研究員生活,成為串聯您與中研院的橋梁,通往博大精深的知識世界。
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