更快、更銳利的四維度電子顯微鏡

• 本文轉載自科技大觀園，原文為《近場光學顯微術，開啟奈米世界大門》
• 作者／簡靖航｜科技大觀園特約編輯

傳統光學顯微技術發展幾個世紀之後，從 20 世紀後半⾄今，突破光學繞射極限成為顯微技術的重要課題。繞射極限是光波所能聚焦的最⼩尺寸（約為光波長的⼀半，以可⾒光來說約 200-350 nm），仍遠⼤於分⼦和奈米材料。顯微鏡的發明是進入微觀世界的⾥程碑，⽽突破光學繞射極限後就能開啟進入奈米世界的可能性。 

突破光學繞射極限的超⾼解析度顯微技術⼤致上可以分為遠場（far field）與近場（near field）兩⼤類，這兩者的差別在於是否利⽤探針在靠近樣品距離遠⼩於⼀個波長（約數⼗奈米）處進⾏量測，若有則為近場，其餘則屬於遠場。⽽遠場顯微技術若要達到奈米級別的超⾼解析度， 需要以特殊螢光標定加上大量電腦計算來輔助。 

中央研究院應⽤科學研究中⼼研究員陳祺，專攻近場光學顯微術，屬於探針掃描顯微術（Scanning probe microscopy, SPM）中與光學相結合的分⽀。 

探針掃描顯微術，家族成員眾多 

探針掃描顯微術泛指使⽤探針來掃描樣品的顯微技術，依照原理的差別再細分成多個類別。在整個探針掃描顯微術家族中，最早的成員為 1981 年問世的掃描穿隧顯微鏡（Scanning tunneling microscope, STM），其主要機制是偵測探針與待測物表⾯間的量⼦穿隧電流（註1），作為回饋訊號來控制針尖與待測物的距離，⽽得到待測物表⾯次原⼦級別的高低起伏。1986 年發明的原⼦⼒顯微鏡（Atomic force microscope, AFM）則是⽬前最廣為應⽤的探針顯微技術，其以針尖接觸（contact）或輕敲（tapping）物體，藉由偵測針尖和物體表⾯間之凡得瓦⼒，得知物體表⾯的高低起伏。 

在探針掃描顯微術中，控制針尖與物體的相對距離是重要的課題，STM 可控制距離在一奈米以下，AFM 則可在一奈米到數十奈米間變化。此外，要在奈米世界「移動」並不是⼀件簡單的事。因為⼀般以機械⽅式的「移動」，其尺度都會在微米級別以上，這就像是我們沒有辦法要求⼤象邁出螞蟻的⼀⼩步⼀樣。所幸 1880 年居禮兄弟發現壓電材料會因為外加電場，⽽導致晶格長度的伸長或者收縮，即可造成奈米級別的「移動」。⽬前所有的探針顯微術都是以壓電效應達成對針尖或樣品「移動」的控制。 

近場光學顯微術，探針加上光 

依 STM/AFM 控制針尖的技術基礎，外加光源於針尖上，即為近場光學顯微術（Scanning near-field optical microscopy, SNOM），依照光源形式的不同可區分為兩⼤類： 

1. 微孔式近場光學顯微術（aperture SNOM，簡稱 a-SNOM） 
2. 散射式近場光學顯微術（scattering SNOM，簡稱 s-SNOM）

a-SNOM 是利用透明的 AFM 針尖，先鍍上⼀層⾦屬薄膜，並打上⼩洞，讓光從⼤約 50-100nm 左右的⼩洞穿出，得到⼩於光學繞射極限的光訊號。s-SNOM 則是外加雷射光源聚焦於針尖上，並量測散射後的光訊號。其中，針尖增強拉曼散射光譜顯微鏡（Tip-enhanced Raman spectroscopy, TERS）是屬於 s-SNOM 的⼀種特殊近場光學模式，主要為量測拉曼散射光譜，即可識別分⼦鍵結的種類。由於拉曼訊號相對微弱，透過探針鍍上⾦屬薄膜，即可利⽤針尖端局域電場的放⼤效果，來增強待測物的拉曼訊號，並利用針尖的移動來得到奈米級空間解析度的拉曼成像。 

陳祺的研究歷程與觀點

在陳祺就讀博士期間，其研究領域主要為結合低溫超高真空 STM 的單分子光學量測，需要極度精進探針掃描顯微鏡的穩定與解析度。畢業之後將⽬標轉向室溫室壓下的探針掃描顯微術與光學的結合，用以量測更多種類和不導電樣品。

陳祺在博⼠後期間的⼯作以 TERS 為主，曾發表解析度⾼達 2 奈米以下的成果，維基百科的 TERS 條⽬，也引⽤了陳祺當時發表在《Nature Communication》的論⽂。回國進入中研院之後，陳祺也開始 a-SNOM 的研究。

無論 TERS 或 a-SNOM，兩者的實驗設計都是建構在 AFM 上，因此陳祺會⾃⾏架設更精準的 AFM，以達成近場光學顯微術更佳的穩定性。 

近場光學實驗操作上的困難除了針尖的製作之外，穩定的 AFM 掃描其實也相當不容易，是維持針尖品質的關鍵。傳統上 a-SNOM 都是以接觸式（contact mode）的 AFM 方式掃描，以防止輕敲式（tapping mode）起伏會干擾光訊號，代價就是 AFM 的解析度極差。陳祺將⾃架的近場光學實驗放進⼿套箱裡，能讓針尖在輕敲式時維持極⼩的振幅（在⼀個奈米以下），可以大幅提高 AFM 的形貌解析度，也幾乎不損傷針尖。由於陳祺有非常豐富⾃架儀器的經驗，才能很⼤程度突破⼀般商⽤儀器的限制。 

⼀般認為 TERS 有較佳的解析度，但由於 TERS 在散射訊號影像上有很大程度的不確定性，經常導致假訊號或假解析度的發生。近年來陳祺反⽽把研究的主軸轉向 a-SNOM，因為她更看重是否能由 AFM 得到的材料結構和高度，來解釋近場光學所量測的結果，以期研究材料背後的物理或化學現象。

另外，陳祺近期最重要的突破是在⽔中完成 a-SNOM 的量測，將針尖與光學元件整合在自製的腔體（cage system）之中，得以在保持生物樣品的活性之下得到超高解析度的影像，這將是開啟利用近場光學研究⽣物課題的重要⾥程碑。

最後，⾝為擁有兩個孩⼦的女性研究員，「如何兼顧⼯作與家庭」或許是⼀般新聞媒體會問的問題。然⽽，陳祺分享⾃⼰的⼼得：「是不可能兼顧的啦！先集中精神做好⼀件事，等另⼀件要爆掉的時候再去救它。」可能坦承⾃⼰沒有辦法做好每件事， 反⽽讓陳祺在實驗上永遠能找到促使⾃⼰改進的動⼒。 

註解

註 1：量⼦穿隧電流：在量⼦世界中，物質同時具有波動和粒⼦的特性。因具有波動的性質， 當電⼦撞擊⼀層很薄的障礙物時，有不為零的機率穿過去，並產⽣穿隧電流（tunneling current ）。穿隧電流與障礙物厚度成指數函數遞減，因此可藉由量測穿隧電流強度計算出待測物表⾯極微⼩的⾼低起伏。

生物體中的蛋白質分子通常長得非常複雜，不是幾行化學式能解決的。如果想把它的分子結構鉅細靡遺的描繪出來，你有幾種選擇。

讓人類發現 DNA 雙股螺旋的 X 光晶體學

其中一個是 X 光晶體學，也就是讓許多蛋白質分子一同排列成整齊的晶體，接著將 X 光打進去，用繞射圖案進行分析。從 1950 年代以來，科學家便常常使用這種技術來探索分子結構。DNA 的雙股螺旋結構便是透過 X 光晶體學被發現。

不過這種方法有其根本上的限制。X 光晶體繞射後的強度很弱，必須藉由晶體內多個重複且整齊的晶格，進行同步繞射來增強訊號，因此沒辦法處理太大的蛋白質分子（單位體積內重複晶格太少），或是結構複雜的蛋白質（像是核糖體是由兩個次單元組成的），而且因為 X 光晶體學仰賴的是晶體結構的繞射，那些無法好好結晶的蛋白質，便不在它的防守範圍內，而細胞中許多的蛋白質都很難形成整齊的晶體。

另外，就算可以成功的結晶，被結晶的蛋白質分子也無法呈現出平常運作時的多種風貌，產生的影像也無法捕捉關於分子的任何動態資訊。

不斷跨越解析度門檻的低溫電子顯微技術

於是我們有另一個選項：低溫電子顯微技術 (cryo–electron microscopy) 。待觀察的分子被凍結在超低溫環境中，而研究人員用電子束轟炸分子，透過電子留下的影像來還原分子的立體結構。這種技術不需要蛋白質進行結晶，不過解析度普遍較差，最後的影像往往只能看出幾個模糊的團塊，因此通常只會用在大的蛋白質分子。

隨著相關領域人員的持續努力，低溫電子顯微的解析度已經大有進展。2017 年的諾貝爾化學獎便是頒給三位科學家在高解析度低溫電子顯微技術方面的突破。前一陣子的紀錄保持者是日本團隊對缺鐵基蛋白 (apoferritin) 的研究，解析度到達 1.53 埃。不過如果想要清楚的呈現個別原子，解析度差不多需要到達 1.5 埃，還差了一些。

在今年十月 Nature 期刊的一篇最新研究中，一個跨國研究團隊利用改良過的電子束與分析軟體，成功達到了 1.25 埃以上的解析率，足以清楚標示出每顆原子的位置。

聽起來很厲害，不過這代表的是什麼？

由於生物分子可以在行動中被降溫並「定格」，我們現在能夠清楚的看見蛋白質這類複雜的分子機械如何運作，清楚到每顆原子的動態都盡收眼底。毫無疑問地，這樣的技術將為分子與結構生物學帶來重要的進展。

目前，原子等級的解析度只適用於結構較堅硬的蛋白質分子。做為下一階段的目標，研究團隊希望能將同樣的技術運用在一般柔軟的大型蛋白質結構，並達到一樣好的解析度。在結構生物學的領域中，使用低溫電子顯微鏡的研究人口逐年成長，而這次的技術突破有望繼續加速這個趨勢。

參考資料

1. Yip, K.M., Fischer, N., Paknia, E. et al. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature 587, 157–161 (2020).
2. Cryo–electron microscopy breaks the atomic resolution barrier at last
3. X-光晶體繞射學與結構生物學

• 撰文｜呂杰翰、黃鈺珊、呂萱萱；美術編輯｜林洵安

超解析 3D 層光定位顯微鏡

中研院江安世院士、應用科學研究中心陳壁彰助研究員，共同開發了「透化層光定位顯微鏡」，一次解構果蠅全腦的多巴胺神經網路，並可「看見」記憶蛋白在特定神經細胞突觸上的新生，此新技術可望揭開大腦記憶機制的神秘面紗。研究論文已於去（2019）年 10 月 18 日刊登在《自然通訊》（Nature Communications）。跟著研之有物一起來了解！

一個細微的動作、一絲情緒起伏，都是由千絲萬縷的神經網路，以及大量訊息傳遞的化學分子交錯作用的結果。早期心理學家要解析人類的大腦意識活動，必須對照研究對象的夢境和生活史。然而，大多數人一起床夢境就忘掉八成，還要將夢境和更久遠的童年記憶連繫起來，說佛洛伊德有多心累都不為過。

如今神經科學家有螢光蛋白與基因工程等工具在手，可先給予模式生物（如果蠅）特定刺激，然後用螢光定位腦內參與活動的生化分子（如某些與記憶有關的蛋白質分子），了解刺激前後分子如何重新分布，以此推測它們在腦部活動中所扮演的角色。

• BUT！因為可見光無法穿透較厚的組織，過去研究者只能將腦組織切成薄片，才能用顯微鏡觀察。但切片會破壞大腦的整體性，無法忠實呈現完整的神經結構。

國立清華大學腦科學研究中心、中研院院士江安世與中研院應用科學研究中心助研究員陳壁彰，合作研發出可透視果蠅全腦的超解析 3D 層光定位顯微鏡，並利用化學方法把果蠅大腦變「透明」、可見光能通過，終於得以窺見果蠅腦部深處被螢光標定的單分子神經，藉此建構果蠅全腦神經網路地圖。

去年團隊藉著這項技術，「看見」記憶蛋白在大腦深處特定神經細胞突觸上的新生，初步揭開大腦記憶的神秘面紗。

精彩故事，是這麼開始的……

解析度、廣度，統統都要！

先來說說傳統顯微鏡的問題！傳統光學顯微術能夠解析的最小距離，大約 250 奈米左右。也就是說，如果兩個發光分子之間的距離小於這個極限，因為光波的繞射特性會使分子影像變得模糊。這個鑑別距離極限，定義了光學成像的「解析度」。

傳統光學顯微術的「繞射極限」，硬生生地限制了科學家一窺腦部全貌的夢想。

大腦神經突觸的大小約在 20 到 40 奈米之間，與腦部分子活動相關的神經結構尺度也在數十奈米。可想而知，運用傳統「粗線條」的光學顯微術觀察大腦，一定會有「見林不見樹」的問題：即使可知大致的神經走向，也無法得知細微變化。但魔鬼，就是藏在細節裡啊~~

另一方面，傳統顯微鏡還有視野廣度或視野大小的問題。神經突觸的大小是果蠅大腦 ( 約數百微米 ) 的數千分之一。想要解析特定分子在大腦的分布，困難度就像用小小無人機空拍一個籃球場，還要定位籃球場上每隻螞蟻的正確位置。

但在顯微鏡的世界裡，解析度和視野廣度本是兩個極端，想要一種技術、兩種滿足，必須找到非比尋常的解決之道。

關關難過關關過

首先，這種顯微技術必須能夠定位腦神經細胞中個別分子。衡量各種超解析顯微術的優勢與適用範圍，「單分子定位顯微術」（single molecule localization microscopy) 具有數十奈米等級的空間解析度，得以鑑別相距約 20 奈米的分子，恰好符合神經生物學家對解析度的要求，無疑是首選工具。

再者，因為神經網路遍佈全腦，並非僅侷限在大腦的表層，此顯微術必須能看得又深又清楚，才能重建果蠅大腦完整的三維影像，提供全面而精密的分子地圖。近年熱議的「層光顯微術」( light-sheet microscopy ) 可快速取得大範圍樣品的影像，成為不二首選

有關層光顯微鏡的介紹，請見研之有物另一好文〈灑下百道層光，一窺微觀世界的生命律動：「晶格層光顯微鏡」如何為細胞拍攝寫真集〉。

再加上，江安世院士團隊透過生物組織澄清技術，運用化學方法讓果蠅腦變透明、能讓可見光通過，然後以層光掃描透明大腦，輔以上述單分子定位顯微術，即可在短時間內偵測大腦內的個別分子位置，稱為「透化層光定位顯微鏡」。

跨領域合作，打開大腦的潘朵拉盒子

有了既定的策略，抽象的概念立刻轉化為一個跨界、甚至跨國的技術整合問題。

陳壁彰助研究員與江安世院士合作，將一個由國家實驗研究院儀器科技中心打造的特殊顯微物鏡，整合入實驗室既有的掃描式貝色層光顯微鏡 (Scanning Bessel beam light-sheet microscope)，建構出針對透明化樣品最佳化的超解析顯微鏡。

並應用日本東京大學 Yasuteru Urano 團隊開發的新型閃爍螢光染劑 HMSiR 標定腦內分子，讓每一個參與大腦記憶生成的分子，發出清晰且明亮的光訊號。

論文第一作者、現任國立清華大學生醫工程與環境科學系助理教授朱麗安興奮地說：身為一個生物學家，使用自己建造的顯微鏡系統，就像打開潘朵拉的盒子，突然什麼都變成可能！

因為商用顯微鏡大多有鏡頭選用、解析度等限制，尤其層光顯微鏡在鏡頭選擇上更是有諸多限制。

那麼，這項新的顯微鏡系統，會對神經科學帶來什麼改革呢？

首先，神經訊號的傳遞仰賴神經突觸電位及神經傳導物質的傳遞，想要了解大腦的活動，必須解析突觸上的細微變化，如蛋白質的生成。以模式生物果蠅為例，神經突觸只有幾百奈米，過去只能仰賴電子顯微鏡。

但電子顯微鏡的樣品製備非常繁複，並需要將組織切片，無法呈現完整的神經結構，一次能看的樣品範圍也很小。電子顯微鏡的另一個問題是「很花時間」。美國珍利亞農場研究園區 (Janelia Research Campus) 所做的全果蠅腦電子顯微鏡連續切片影像，單一個果蠅腦就需花費 16 個月拍攝完成，再經過無數的工程師進行影像處理，不利於統計分析。

透化層光定位顯微鏡，可在比細胞大將近一萬倍的組織（如果蠅大腦），定位其中所有蛋白質分子，進行果蠅全腦的攝影。而且全腦攝影可在一天之內完成，期間僅需移動樣品四次，大幅降低機械移動造成的誤差與後續影像處理的複雜性。與傳統的顯微技術比較，新技術能在合理的時間內拍攝大量樣品，即時提供生物學家更大的統計樣本。

去 (2019) 年初已初步告捷！新的顯微技術一次解構果蠅全腦的多巴胺神經網路，「看見」記憶蛋白在特定神經細胞突觸上的新生，可望揭開大腦記憶機制的神秘面紗。

看見記憶、解密大腦疾病

昆蟲腦部的蕈狀體分布了一種囊泡單胺運轉蛋白質 (vesicular monoamine transporter)，與昆蟲的嗅覺與記憶功能息息相關，是一種在腦部負責訊息傳遞的重要分子。只要標定這種蛋白質分子的精確位置，即可從中歸納出與記憶有關的分子機制。

本次研究發現：在讓果蠅進行特定的記憶訓練後，只有特定的神經突觸會增加囊泡單胺運轉蛋白質表現，顯示這些神經在記憶過程可能肩負重大功能。

藉由類似的實驗，神經科學家可以釐清神經變化和特定腦部活動的關聯，進一步理解神經在腦部記憶生成的機制，以及神經可塑性 (placiticity) 的變化，破解大腦記憶之謎。

另一方面，由於鼠腦被普遍使用於與人類腦部疾病有關的研究，未來江安世院士研究團隊也計畫以此探索老鼠腦，揭密與蛋白質分布有關的機制，對於解答部分人類腦部疾病做出貢獻！

「目前為止，我們已經觀察果蠅在訓練前後的神經活動，並且能夠分辨尺度在數十奈米左右的變化，這對釐清分子在神經可塑性中扮演的角色提供很大的幫助。」朱麗安期許未來：「十年後的目標是將影像解析度提升到 10 奈米，並試著應用於活體，即時觀察神經在腦部活動下的重塑，終極目標是理解學習行為的詳細機制！」

也許不遠的未來，新的顯微技術可以觀察生物學習當下發生的每一個細微腦部變化，解密人之所以為人，是如何從經驗學習成長。

延伸閱讀

• 陳壁彰個人網站
• 江安世個人網站
• 朱麗安個人網站
• Rapid single-wavelength lightsheet localization microscopy for clarified tissue
• 灑下百道層光，一窺微觀世界的生命律動──晶格層光顯微鏡
• 前瞻生物顯微技術交流版

本文轉載自中央研究院研之有物，原文為《「看見」大腦記憶的生成—-超解析 3D 層光定位顯微鏡》，泛科學為宣傳推廣執行單位