70奈米高的花瓶?科學家們先作了一個個的DNA圈圈,把他們疊在一起後再把它們接起來,就成了上面的這個花瓶。
當然,這麼小的花瓶要看到不可能用肉眼,上面這張照片是用原子力顯微鏡照的。
70奈米高的花瓶能作什麼呢?科學家們希望可以把藥品或酵素放在裡面,或許外面的DNA花瓶可以保護裡面的內容物,讓它可以送到指定的地點。
資料來源:ScienceShot: A Vase Made From DNA – ScienceNOW
本文原發表於Miscellaneous999[2011-04-16]
70奈米高的花瓶?科學家們先作了一個個的DNA圈圈,把他們疊在一起後再把它們接起來,就成了上面的這個花瓶。
當然,這麼小的花瓶要看到不可能用肉眼,上面這張照片是用原子力顯微鏡照的。
70奈米高的花瓶能作什麼呢?科學家們希望可以把藥品或酵素放在裡面,或許外面的DNA花瓶可以保護裡面的內容物,讓它可以送到指定的地點。
資料來源:ScienceShot: A Vase Made From DNA – ScienceNOW
本文原發表於Miscellaneous999[2011-04-16]
本文轉載自顯微觀點
DNA-PAINT 屬於單分子定位顯微術(SMLM)大家族一員,它突破繞射極限的途徑類似 PALM 與 STORM:以閃爍(blinking)的螢光讓多個目標分子的位置輪番呈現,最後將多次定位影像以電腦疊合重建成完整的超解析分子地圖。結合電腦運算輔助和光學成像的統計原理,DNA-PAINT 可以達成極端細緻的 RESI 定位術,清楚區別兩個距離不到 1 奈米的螢光來源。
單看字面,DNA-PAINT 給人「以 DNA 作為油漆」的印象。事實稍有不同,這種技術以 DNA 作為「點累積奈米成像術」(PAINT , Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography)的探針。接上螢光染劑的短小 DNA 片段,可以靈敏標記蛋白質、染色體以及許多細胞內構造。
DNA-PAINT 的特別之處,在於利用「不牢固」的螢光標記製造閃爍效果。不同於 PALM, STORM 以光調控「固著在目標上」的螢光來源,DNA-PAINT 使用與目標連結力量薄弱的螢光探針,結合目標之後會快速分離。只有在探針與目標結合的瞬間,同時被激發光照射,探針上的螢光團才能發出螢光。目標分子與螢光探針分離後,依然保有和下一個探針結合的能力,因此不必擔心螢光團的放光能力衰退。
DNA-PAINT 使用的 DNA 探針片段長度不超過 10 個鹼基,又稱寡核苷酸(oligonucleotides 或oligomers)。這些短小 DNA 片段可以附加上螢光染劑的螢光團分子,成為螢光探針。
DNA 探針的結合對象是另一段互補的 DNA 片段,此互補序列會預先透過抗體與定位目標連結,等待 DNA 探針前來結合。DNA 探針因為具有螢光團,被稱為「成像片段(imager strand)」,而牢固於目標的互補序列則稱為「嵌合片段(docking strand)」。對生物細胞進行 DNA-PAINT 時,嵌合片段與目標分子之間常有抗體或配體做為銜接,需要類似免疫螢光染色的前置作業,目標表面的抗原也可以因應實驗需求進行設計。
因為兩個短小 DNA 片段之間的結合力有限,成像片段與嵌合片段結合後會快速分離。而螢光團只有在結合目標時才容易放光,因此可以形成閃爍的螢光定位標記。經由電腦疊合閃爍的定位影像,DNA-PAINT 可以達成 10 奈米左右的超解析定位,若沒有序列成像的幫助,依然無法突破奈米以下解析度的光學障礙。
核孔複合體(Nuclear Pore Complex)上的 Nup96 蛋白是科學家經常探索的重要目標,即使是超解析顯微術也未能在自然狀態下呈現其構造。隆曼團隊以 RESI 對 Nup96 進行定位,不但清楚定位出符合電子顯微鏡拍攝的 8 對 Nup96 蛋白沿著核孔形成環狀結構,還能清楚呈現每對蛋白之間的 11 奈米的間距。
結合序列成像(Sequential Imaging)與 DNA-PAINT 兩種技術,RESI 讓科學家得以運用一般門檻的顯微儀器、耗材,就能達到超乎以往想像的定位解析度。而 DNA-PAINT 這種巧妙的定位方法並非一蹴而就,而是數種有趣的技術累積而成。
PAINT(Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography, 點累積奈米成像術)系列定位法的螢光探針由一個螢光染劑分子與一個分子探針(probe)構成。親和性抗體、寡核苷酸(短小 DNA 片段)都可作為分子探針的材料,再由此探針結合目標分子或其上的抗體。除了 DNA-PAINT, PAINT 家譜上還有 FRET-PAINT, Exchange-PAINT, u-PAINT 等不同特質的成員。
在 2006 年由沙羅諾夫(A. Sharonov)和霍克崔瑟(R. M. Hochstraser)發表的第一代 PAINT 中,僅僅使用螢光染料尼羅紅(Nile Red)為標記。這種染劑在含水溶劑中無法發光,必須進入磷脂層等非極性環境才能展現其螢光活性。
因此尼羅紅無須結合探針,只要以低濃度加入樣本溶液中,就能觀察到其進入細胞膜脂雙層、大型磷脂囊泡(large unilamella vesicles)表層等疏水性環境中,受到激發放出螢光。尼羅紅與磷脂層的親和性不強,很快就會再次脫離,也容易遭到光漂白(photobleaching)而失去螢光,因此可作為一種閃爍的螢光定位標記。
尼羅紅可以結合所有疏水性(hydrophobic)的構造,無法真的標記特定分子,缺乏分子生物學重視的專一性。但它開啟了 PAINT 以「不牢固螢光染劑」增進解析度的先河。與多數螢光顯微術追求螢光團穩定性與強度的定位技巧背道而馳。
4 年後,吉安諾內(G. Giannone)和荷西(E. Hosy)以具目標專一性的配體,例如抗體蛋白,連接螢光團形成螢光探針,達成具有專一性的 PAINT 超解析定位。透過進步的生化技術製作配體,這種技術幾乎可以定位所有類型的目標,因此被命名 universal-PAINT, 簡稱 uPAINT。
uPAINT 可以提升多種目標的定位解析度,但其螢光探針即使游離在溶液中,也能接受激發、放出螢光,形成背景雜訊。且結合螢光染劑的抗體無法穿透細胞膜,因此只能定位細胞膜上的目標。
因此 uPAINT 必須限縮激發光照射的範圍,對準目標、減少雜訊,例如微調全內反射顯微鏡(TIRF)的角度,形成「高傾斜層光照明」(Highly Inclined and Laminated Optical sheet, HILO)以限定激發範圍。
同在 2010 年,隆曼與史坦豪爾(C. Steinhauer)嘗試以寡核苷酸為探針,定位 DNA 摺紙構造(DNA origami structure)上的目標,達到了奈米等級的解析度。DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography 正式誕生,善用「不牢固的螢光探針」與電腦運算的輔助,以一般螢光顯微鏡就能突破繞射極限。
2014 年,隆曼與同事阿凡達尼歐(M. S. Avendaño)、沃爾斯坦(J. B. Woehrstein)發表 DNA-PAINT 的巧妙變化,除了同時以不同探針標記不同構造,達成精準的多重定位(multiplexed localization),更實現以一種螢光超解析定位多種目標,讓多重標記的潛力加速實現。
這種多重標記被隆曼與同事稱為 Exchange-PAINT,同樣使用 DNA 片段作為探針。在同一個樣本的 10 種不同目標上,連結了 10 種不同的嵌合片段(docking strands),隆曼等人再以 10 種互不干涉的短小 DNA 序列(orthogonal sequences)作為成像片段(imager strands)。
他們每次只加入一種成像片段,針對一種目標進行閃爍(blinking)定位,並由電腦套上特定顏色,接著洗去既有成像片段,再加入下一種成像片段。最後將所有目標的獨立定位圖疊合起來,便能得到完整的奈米級定位。
只需要一種螢光染劑接上多種成像片段,Exchange-PAINT 便能以基本的實驗設備達到多重目標的超解析定位,不像多重標記的 DNA-PAINT 受限於染劑顏色數目,Exchange-PAINT 的門檻在於互不相干寡核甘酸片段的數目,在實驗中幾乎不可能窮盡。而可以使用一般螢光顯微鏡與螢光染劑達到埃(ångström)解析度的 RESI 技術,就是將 Exchange-PAINT 的多種目標定位應用於單種目標定位,透過不同探針標記同種目標製造發光順序落差,大幅提升解析度。
在「眼見為真」的生物學影像趨勢中,「增加偵測光子數量」是螢光顯微技術提升解析度的基礎光學原理,也是最主流的技術改良方向。而 DNA-PAINT 系列技術跳脫了對光子數量的追求,不受螢光染劑的光漂白及螢光壽命限制,以快速脫落的探針另闢蹊徑,使低成本的超解析影像得以實現,更展現生物物理學蘊藏的廣泛技術可能性。
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本文轉載自顯微觀點
電腦運算是近 20 年來生物影像突破繞射極限的可靠工具,例如 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), PALM(Photo-Activated Localization Microscopy),以電腦記憶、疊合,將多次拍攝的零散螢光重建成完整輿圖,解析度極限可接近 10 奈米。
現在,透過電腦輔助的序列成像解析度增強術(RESI, Resolution Enhancement by Sequential Imaging),科學家能將細胞內分子的定位解析度大幅提升到埃(Ångström, Å.等於1/10奈米)的尺度,清晰定位緊鄰的分子、觀察它們在細胞內的變化。
RESI 定位可呈現 DNA 相鄰鹼基間距,超越超解析顯微鏡,達到與電子顯微鏡同等的解析度,而且只需基本的細胞固定,近乎完全保持樣本原貌。
在德國馬克斯.普朗克生化研究所率領團隊研發 RESI 的榮曼(Ralf Jungmann)認為,RESI 能填補介於光學顯微術與結構生物學之間的資訊空白,揭露更多複雜生命系統的真相,為分子生物學與藥物動力學開闢道路。
使 RESI 成為「超級超解析」定位術(super-super resolution)的核心概念,是以不同 DNA 螢光探針對目標進行多次標記定位,定位過程由電腦為目標編上號碼(DNA-barcoding),使「發光順序」成為分辨目標的新維度,並以「定位次數」來大幅提升解析度、為量化分析提供充沛樣本。
例如,淋巴癌與自體免疫疾病的關鍵標靶:B 細胞表面 CD20 蛋白﹐雖然早已發現是重要的癌細胞特徵,也確認有效藥物,但其結構與分子動力學依然曖昧不明,學界對它的了解還不足以研發進一步療法。
儘管 CD20 蛋白的結構已被電子顯微鏡呈現,但電子顯微鏡的拍攝條件會破壞細胞膜結構,導致 CD20 變形、偏移。現在透過 RESI 進行定位,CD20 的構造、藥物效果,都可以在接近生理狀態下一探究竟。
在 RES I分析下,榮曼等學者發現 CD20 總是成對出現(as dimers),並且在關鍵藥物 RTX(一種抗 B 細胞的單株抗體)加入後,會在細胞膜上聚集成緊密的長鏈。這些資訊是過往電子顯微鏡與超解析光學顯微鏡都未曾展現的。
各種超解析單分子定位術的共同難題,是兩個目標分子過於接近,連電腦運算也無法辨別。假使兩個距離 1 至 2 奈米的相同分子輪流被激發,PALM, STORM 等仰賴隨機放光的超解析定位術即使分別收到兩個光源的螢光訊號,重建時也容易將緊密的兩者混為一點。
榮曼也強調,當兩個螢光團的距離小於 10 奈米,近場光學效應會大幅影響光調控螢光染色分子(photoswitchable fluorescent dyes)的表現。分辨兩個距離數奈米甚至數埃(Å)的分子,是單分子定位技術的最後關卡。
面對諾貝爾級超解析技術也無法克服的障礙,RESI 巧妙地以「標記」技術避開了光學難關。RESI 採用進化版本的 DNA-PAINT,螢光探針與目標結合轉瞬即脫落,並能使相鄰的目標結合不同探針,避免兩者同時發光,兩個緊密的分子幾乎不會干擾彼此成像。
奠基於隨機放光的單分子定位術(SMLM),序列成像(Sequential Imaging)用不同顏色、不同激發光譜的 DNA 螢光探針,標記鄰近的兩個目標,使兩者輪流發光。如此一來,發光順序便成為辨別螢光標記的新方法:兩個目標距離僅 1 奈米左右,但因為發光順序、螢光顏色不同,在重建過程中能夠被電腦清楚區分。
在真實的細胞中,若想以不同嵌合片段(docking strands)標記鄰近的相同蛋白(例如Nup96 dimer, CD20 dimer),則多少需要仰賴運氣。目前的 RESI 使用隨機標記(stochastically labelling),而非直接指定標記種類與位置。
定位 Nup96 的實驗就是一個例子,榮曼團隊的4種嵌合片段中,需要有 2 種分別標記相鄰的 Nup96 蛋白,才能夠使兩個相鄰蛋白分別依序發光。榮曼強調,得到理想標記的機率,會隨著嵌合片段的種類提升。在榮曼團隊的定位實驗中,RESI 對 Nup96 的定位達到和掃描式電子顯微鏡同等精密的解析度。
榮曼認為:「理論上,透過發光順序的差異,RESI 技術可以分辨無限接近的兩點。」
基於光波繞射的性質,點光源的光線不會透過顯微鏡聚焦為理想的一點,而是呈現一個立體球狀照射範圍。這個讓科學家困擾一個半世紀的照射範圍,就是此光學系統的點擴散函數(PSF, Point Spread Function)。
在顯微鏡焦平面上,PSF 會形成一個中心最亮、四周漸黯的圓形光斑(艾里斑,Airy Disk),若兩個光點的光斑大幅重疊,就會難以辨別。這也就是遠場光學顯微鏡的最大天然障礙:阿貝繞射極限的由來。
包含 PALM, STORM 等超解析技術的單分子定位顯微術(SMLM, Single-Molecule Localization Microscopy)也必須考慮 PSF。它們定位解析度(也稱定位精準度,σSMLM),接近點擴散函數的標準差(σDiff)除以每次定位偵測光子數(N)的平方根:
σSMLM ≈ σDiff / N1/2
解析度數值愈小,代表辨別極限的距離愈近,定位結果愈清晰。超解析定位技術不斷追求的,就是縮小 σSMLM。
在點擴散函數標準差(σDiff)隨儀器性能固定的情況下,每次定位偵測的光子數 N 就是定位解析度的主要變數。多數單分子定位技術,都需要設法提升偵測光子數以看得更清晰。
與其他單分子定位術不同的是,RESI 採用的 DNA-PAINT 探針對目標分子反覆結合、脫落,不斷有新的螢光探針前仆後繼,迅速與目標短暫結合,可以對每個目標累積多次定位。
因此目標的「定位次數」(K)進入解析度數值核心。每個目標定位的解析度由單次定位的點擴散函數標準差(σSMLM),轉變為多次放光定位的平均值標準誤差(SEM, Standard Error of the Mean),其大小和定位次數(k)的平方根成反比。
SEM≈ σSMLM / k1/2 ≈ (σDiff / N1/2) / k1/2
此時只要提升定位次數(k),就可以得到更精密的定位(σRESI),毋須追求更強或更漫長的螢光來增加每次偵測的光子數(N)。再搭配以定位順序區分鄰近分子,RESI 就能得到近乎無限小的解析度。這種靈活的反覆定位模式,有賴 DNA-PAINT 技術奇特的「不牢固」結合(transient binding)搭配榮曼團隊研發的開源影像處理軟體Picasso 合力實現。
(DNA-PAINT 技術介紹請見:DNA-PAINT:短暫標記 奈米解析)
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劉育志醫師:請問什麼是間質性膀胱炎?
蔡青倍醫師:間質性膀胱炎,其實是一個慢性非細菌性的膀胱炎,所以既然是慢性,通常這些病人,會有超過六個禮拜以上,不舒服的情況,怎麼樣的不舒服,其實是很像細菌性膀胱炎的,解尿疼痛、下腹痛,所以它的核心症狀其實是疼痛,它的診斷需要,還有輔助一些下泌尿道的症狀,譬如有一些解尿疼痛,頻尿、急尿,一直要去上廁所,這樣非常困擾的下泌尿道症狀,它的盛行率,其實在女生的族群比較常見,也許有八到九成都是女性的病患,而且相對是年輕的,平均可能是四十幾歲左右,會被做診斷,也因為慢性,所以是無時無刻,可能病人都有覺得這樣的不舒服,在這種解尿疼痛、下腹痛,無時無刻的影響,也因此這些病人的生活品質,是非常的差的,甚至有些人覺得這些病人的生活品質,甚至比洗腎的病人還要來得差。
劉育志醫師:請問在確診間質性膀胱炎,會遭遇哪些困難?
蔡青倍醫師:間質性膀胱炎,基本上是一個慢性的過程,所以很多病人,在一開始的症狀,本來就是比較模糊不清,或者是一開始的症狀,其實是反反覆覆發生,也因為有些病人會在性行為之後,或者是月經來以前,這樣的症狀又再發作,也因此像這樣的疼痛、解尿不舒服,很容易被診斷為泌尿道感染,也許這些病人在給了藥物治療之後,症狀又有稍微得到緩解,沒有再進一步追根究柢,把根本的原因找出來,也有一個文獻說,平均這些病人,要經過七、八年的時間,可能會遇到五到七位,不一樣的主治醫師,最後才得到診斷。
劉育志醫師:請問間質性膀胱炎該如何治療?
蔡青倍醫師:第一步,要先能夠好好的照顧自己,跟疾病能夠長期共處,所以第一點的保守治療,要能夠先了解自己,應該會有一些壓力、情緒,或者是飲食,會讓疼痛、解尿不舒服的情況,又再次發作,所以如果找到自己容易誘發的因素去避免,以平常的生活習慣,維持一個良好的生活習慣,不要有太大的壓力,適當的飲水,去減少發作,在比較一些緊急發作的狀況,會需要用到一些藥物治療,這樣的藥物治療,還是以一些止痛劑,適當的止痛劑,或者是一些膀胱,或者是一些骨盆肌肉,放鬆治療藥物為主,很多病人應該也會問到說,目前有玻尿酸的膀胱灌注治療,這樣的治療其實是藉由玻尿酸的溶液,可以修復膀胱上皮的黏多醣層,對於尿液裡面的一些刺激物,就會比較沒有那麼敏感,這也是病人常常在我們門診,有可能會反覆回來,做灌藥的一個療法,如果口服藥物治療,或者是膀胱灌注治療,可能都沒有辦法紓解,這麼嚴重疼痛的狀況,也會有比較侵入性的,像膀胱進水擴張手術,或者是膀胱鏡的注射手術。
劉育志醫師:請問玻尿酸灌注會如何進行?
蔡青倍醫師:玻尿酸其實是 50 cc 的一個透明的溶液,它的結構因為跟膀胱表皮的,黏多醣層類似,也因此如果能夠灌注到膀胱內側,其實是可以修復,補充破損的黏多醣層,病人的症狀也會獲得緩解,在診間醫師會經由導尿的方式,將 50 cc 透明的玻尿酸,直接灌注到病人的膀胱內側,之後導尿管其實就可以拿掉,病人就可以馬上下來活動,也許過一、兩個小時之後,再自己把玻尿酸,隨著尿液一起排出來,其實就可以了,病人也許在灌注之後的幾天,甚至到幾個禮拜之內,就會覺得這樣的疼痛,解尿不適的狀況舒緩許多。
劉育志醫師:請問玻尿酸灌注治療的選擇,有何注意事項?
蔡青倍醫師:其實在全球而言,這樣的玻尿酸產品非常多,目前真正進入台灣的品項,也都有台灣衛福部的核可,但是大家在選擇這樣的產品,其實可以注意,是不是有標明來源,它的純化,整個過程到底是怎麼樣進行,再來是這些產品,是不是都有比較多的文獻,去佐證它的使用概念,所以其實建議大家,在選擇產品的時候,是可以稍微詢問,玻尿酸的來源跟廠牌。
蔡青倍醫師:她(患者)在來看我之前,的確也經歷了超過五年以上,蠻痛苦的就醫過程,因為她在一開始的症狀,其實是有點反反覆覆,大部分其實是在憋尿之後,開始就會覺得肚子痛、排尿不順,解尿痛的狀況,她就到處去看醫生,反反覆覆、來來回回,她可能看了也許不下十家的醫院,一開始的症狀是會好的,可是在來看我的前面那一、兩年,就發現這樣的症狀,在吃了藥之後,變得好像沒有什麼效果,那一年她其實是沒有辦法上班,所以她的工作也因此就沒有,就變成到處看醫生,可以想像其實她的生活非常痛苦,她的說法是每天尿尿超過二、三十次,在經過膀胱鏡的檢查之後,確定這樣的診斷,我們幫她做的治療,除了口服藥物之外,其實是玻尿酸的灌藥治療,她其實也蠻認真配合,所以在第一個月,她每個禮拜都來報到,她覺得那一個月,是這幾年最大的轉折點,她開始比較有辦法出門,後來她的玻尿酸的灌藥治療,是採用一個比較維持性的療法,也就是每一、兩個月,她再回來接受治療,後面變得非常的穩定之後,我們也慢慢的拉長灌藥時間,可能到兩、三個月,再回來灌藥一次,而且幾乎所有的止痛藥,或者是頻尿的藥物治療,也都不太需要了,給我最大的鼓勵是,她也很高興的回來跟我說,她後來又找到了工作。
蔡青倍醫師:雖然她是一位蠻年輕的病人,目前也才三十幾歲,可是看得出來,她從很年輕的時候,就開始慢慢的出現症狀,經過了那麼長時間,吃藥跟就醫治療,最後找到了確切的治療之後,其實是可以維持一個非常好的生活品質。