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動物世界生命奧祕

在桃莉羊之後：複製猴，生日快樂！

PanSci ・2018/01/25 ・2454字・閱讀時間約 5 分鐘・SR值 572

・九年級

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今天（2018/1/25）《細胞》期刊封面故事，兩隻複製猴「中中」、「華華」去年底在中國上海的中國科學院神經科學研究所，誕生啦！

這是首次使用體細胞核轉移技術（somatic cell nuclear transfer, SCNT）成功複製出的靈長類動物，這兩隻長尾獼猴（Macaca fascicularis）擁有完全一致的基因組，分別出生於 2017 年 11 月 27 日與 12 月 5 日。

體細胞核轉移技術的改良

中中與華華其實並非首次被複製成功的靈長類動物：1999 年科學家也曾成功複製了普通獼猴，但使用的技術較接近於自然狀態下產生同卵雙胞胎的機制。在這次的研究中，科學家使用發展了二十多年的「體細胞核轉移」（somatic cell nuclear transfer, SCNT）技術，最出名的例子便是 1996 年出生的桃莉羊。科學家移除未受精的卵細胞之細胞核，再以另一個體細胞的細胞核取而代之；然後刺激該細胞發育為胚胎，再植入代理孕母的體內。

當初製造桃莉羊的科學團隊，在後續幾年也製造出了四隻相同的綿羊。體細胞核轉移技術在後續的研究中被應用在二十種不同的動物身上，包括青蛙、小鼠、大鼠、豬、牛甚至是狗。

「（這項技術）在非人類的靈長類物種上曾經嘗試過非常多次，但都失敗了。」論文共同作者、中科院上海神經科學研究所蒲慕明說。科學家長期認為猴子的基因有些因素讓此項技術無法成功，團隊本次的成功建立在很多實驗的改良上。

由中國科學院孫強研究員率領博士後研究員劉真為首的團隊調整了很多技術細節，從細胞核轉移到細胞融合內容。團隊花了三年完成這些調整，其中一個最主要的成功要素在於團隊使用了胚胎細胞核而非成體細胞核。其他調整內容還包括在胚胎早期階段注入經處理的 Kdm4d mRNA 並且使用組蛋白脫乙醯酶抑制劑（histone deacetylase inhibitor）trichostatin A 處理胚胎細胞，這些處理可以大幅增加懷孕的成功率。

團隊在研究中分別使用了體細胞以及胚胎纖維母細胞（fetal fibroblast）的細胞核。但成功率還是有限的：來自體細胞的胚胎分別植入了 42 個代理孕母體內，22 例成功懷孕，有 2 隻出生但很快就夭折了；來自胚胎纖維母細胞的胚胎則植入了 21隻代理孕母體內，6 例成功懷孕，而成功出生的 2 隻小猴子就是「中中」和「華華」。

華華與中中目前分別為六週和八週大，由人工飼養長大，目前看起來發育生理上沒有任何問題。預計這幾個月將有更多小猴子出生。

「這兩隻小猴子非常活潑而且健康，他們就像人類的小孩一樣成長得很快。」論文通訊作者孫強說：「牠們看起來越長越活潑，而且沒有任何不正常。」

其他科學家怎麼看？

其他科學家表示有限的成功率代表了還需要更多的實驗，弗朗西斯 · 克里克研究所（Francis Crick Institute）胚胎發育與幹細胞研究部門的 Robin Lovell-Badge 說：「即使他們成功獲得了複製猴，但目前的數量太少，不足以達成任何結論，實驗效率仍然很低而不順利。」

「的確必須找到這（低生育率）相關的規則證據，」科羅拉多州立大學生生物醫學系助理教授 Jennifer Barfield 說，她從事的研究嘗試在美國野牛保育上做一樣的事情，她認為這項工作相當有趣且重要：「尤其是對於靈長類來說，成功並非隨手可得。」

「值得恭喜，我知道這件事有多難。」奧勒岡健康與科學大學的複製專家 Shoukhrat Mitalipov ，曾在 2000 年左右使用了超過 15,000 個猴子卵細胞嘗試進行複製，但沒能成功生出任何小猴子。

那麼，之後呢？

中國科學院神經科學研究所的團隊將會繼續優化體細胞核轉移的技術，並持續觀察中中與華華未來的生理與心理發育狀況。他們在發表的論文中表明希望他們的研究最終可以應用於了解人類疾病，如能加入現在的基因剪輯技術複製疾病的狀況等。希望能夠將複製猴應用於遺傳疾病的研究，如帕金森氏症、阿斯海默與亨丁氏症等。

「非人類的靈長類對於生醫領域的研究非常重要，」James Bourne ，澳洲蒙納許大學助理教授，國家健康與醫療研究顧問的資深成員說，「複製猴作為基因上與人類很相近的物種，可以成為醫學研究的重要工具。」

如果可以有效率提供擁有相同基因的實驗猴，預期將能應用於像是生醫、藥學領域。有些科學家認為能夠複製靈長類動物，對於研究人類疾病將有極大的幫助，在過去的實驗環境中，我們難以排除結果是由於實驗處理、或是個體的基因差異，而如果能使用複製動物進行醫學與藥理的實驗，便能更快速得到結果。

避免不了的倫理議題討論

這兩隻小複製猴的誕生也激起了相關的倫理爭論。人類也是靈長類的成員，科學家打破了複製靈長類的技術障礙，理論上也代表我們離複製人又更近了一步。論文的作者聲明他們無意複製人類，但他們也相信這項實驗會再度引出對於複製生物研究的規範討論。

英國肯特大學基因學的教授 Darren Griffin 說：「該是時候謹慎思考此類基因實驗『容許』及『應當』如何操作的倫理框架了。」他指出，將有批評湧出：「這項實驗結果將可以滑坡推演出我們距離複製人類又更近了一步。」但無論如何，Griffin 認為這項實驗的益處相當明確：「我個人對於此項研究的結果相當審慎樂觀，這是個非常令人印象深刻的技術突破。」

原始論文：

Zhen Liu, Yijun Cai, Yan Wang, Yanhong Nie, et al. Cloning of Macaque Monkeys by Somatic Cell Nuclear Transfer. CELL, 2018.01.20

參考資料：

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豬隻器官移植新突破：CRISPR技術攻破了「豬內源病毒」的瑪利亞之牆！

寒波・2017/10/11 ・2824字・閱讀時間約 5 分鐘・SR值 558

・八年級

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現代醫學研發出器官移植的技術，但是材料卻遠不足夠，等待捐贈器官的病患大排長龍，大多數人一生都等不到。人類是動物，器官是肉做的，其他動物也是，那麼何不借其他動物的器官一用？

「借」我的器官用？哼！圖／取自《Science》新聞〈CRISPR slices virus genes out of pigs, but will it make organ transplants to humans safer?〉

缺乏移植器官，借豬的一用

將其他生物的組織、器官，移植到人類身上，有個酷炫的名詞「Xenotransplantation」，翻譯作「異種器官移植」。豬是已知各種動物中，最適合作為人類器官的來源，然而要將豬的器官，如心臟移植進人體，仍有重重難關有待克服，目前還沒有成功案例。

異種器官移植至少有三大潛在問題。第一，免疫排斥。以豬舉例，儘管豬已經是最適合的移植對象，但畢竟人豬殊途；將豬的器官移植進人體後，人類免疫系統會將其視為外來者（也真的是外來者）攻打，導致手術失敗。第二，生理不相容。也就是豬的器官，無法在人體順利運轉。[1]

延伸閱讀：動物器官移植到人身上，異種移植可行嗎？

靠著基因改造豬與藥物控制，以上兩個問題，都已達到相當程度的改善。而最近發表在《Science》期刊的論文，則是針對另一個問題，有了令人振奮的進展。異種器官移植的第三個潛在問題是：豬病毒感染。[2]

用 CRISPR-Cas9 成功消滅豬的內源反轉錄病毒，培育出基因改造豬，上了當期《Science》封面。圖／取自《Science》封面

住在基因組中的古老病毒

等等，這問題很好解決吧！假如豬帶有病毒，那麼只要讓等待供應器官的豬，從胚胎開始就養在無菌環境中，不就能避免牠們長大以後，將病毒傳染給人類嗎？

問題當然沒有這麼簡單，別誤會，這裡的「豬病毒」不是住在豬身體內的病毒，而是躲在豬的基因組中，以 DNA 序列方式存在的內源性反轉錄病毒（porcine endogenous retrovirus，縮寫為 PERV）。這些病毒就是豬本身的遺傳序列，不可能直接外加藥物消滅。

事實上，人類跟豬一樣，基因組中也存在不少這類病毒。在人類的演化歷史上，基因組不斷更替，曾有許許多多外來的轉位子（transposon）插入我們祖先的 DNA 序列，也順便引進不少病毒，後來成為基因組的一部份。（人類基因組廣義看來，共超過 40% 是由各式轉位子所引進，來自病毒的只占相對比例，很低的一小部分）

經過長期的演化淘汰，能在基因組中留存下來的病毒，都成為「內源性」的病毒，屬於跟隨細胞正常複製程序的固定成員，絕大部分時候安份守己。我們的免疫系統，除了抵抗外來的入侵者以外，另一重要任務，正是防範這些原本的病毒遺傳物質，哪時候又掙脫枷鎖，跑出來作亂。

人的基因組中，有人的內源性反轉錄病毒，我們的遺傳與免疫體系可以壓制它們。豬的基因組中也有豬的內源病毒，它們在豬的體內受豬控制，當然對豬不成問題，然而，假如把豬的器官移植給人類，豬的病毒在陌生的人體環境中，很可能成為擺脫拘束器的殺人狂魔。（反過來說，把人類器官移植給豬，應該也會發生類似的事，不過此一狀況大概沒有機會上演）

將豬與人的細胞株共同培養，豬的 PERV 會轉移到人類的細胞株，而且愈久愈嚴重。圖／取自 ref 2

豬的內源病毒會傳染給人

怎麼解決？既然病毒就是豬基因組的一部份，不可能以外加藥物處理，那麼只能直接編輯豬的基因組，先把 PERV 序列消滅。

不過，目前仍缺乏將豬器官移植給人的資訊，豬的病毒在人體作亂，想來儘管嚴重，卻純屬假說，真的值得大費周章去改造 DNA 培養基改豬嗎？新發表的論文，首先進行了一系列實驗，證實 PERV 的病毒危機並非危言聳聽。

豬的內源性反轉錄病毒可分為三種：PERV-A、PERV-B、PERV-C，在豬的基因組中合計有 62 個之多。將源自豬的 PK15 細胞株，與來自人類的 HEK293T 細胞株一起培養，過了很多代以後，人類細胞的基因組中也能偵測到 PERV（有 A 有 B，沒有 C），而且數目隨代數增加愈來愈多，證實 PERV 確實有能力由豬的細胞向人入侵。

將帶有 PERV 的人類細胞株，與未接觸過豬細胞株的人類細胞共同培養，PERV 能夠轉移到新的人類細胞。圖／取自 ref 2

為了測試 PERV 在人體的轉移能力，實驗團隊接著將受到 PERV 感染的人類細胞株，與新的人類細胞株共同培養。結果是，即使從未接觸過豬的細胞，只要樣本中存在來自豬的 PERV，它仍然能傳播給新的人類細胞。

儘管以上只是非常簡單的體外測試，與免疫系統存在、複雜的人體環境大不相同，不過仍足以證明跨物種的豬病毒感染，是器官移植時不可忽視的風險。畢竟，移植時為了降低排斥反應，勢必會先用藥物抑制人體的免疫作用，這正是病毒轉移的良機。

用 CRISPR-Cas9 改造豬的胚胎纖維母細胞，消滅基因組上頭的一大堆 PERV，創造出不會表現 PERV 產物的改造豬細胞。圖／取自 ref 1

器官移植新希望－沒有內源病毒的豬寶寶

靠著近來當紅的基因編輯工具 CRISPR-Cas9，研究團隊之前已經成功消滅過豬細胞株的 PERV 序列 [3]。不過，假如目的是器官移植，那麼就要改造豬的初級胚胎纖維母細胞（primary procine fetal fibroblast，這邊用的型號稱作 FFF3），才能培育長大後用於移植的個體。

FFF3 細胞的基因組上，共有 25 處活躍的 PERV，都是需要以 Cas9 精準打擊、根除的目標。兩款 gRNA 被用於導引 Cas9 前往攻擊，然而初步結果顯示，戰況非常慘烈；看起來，大規模同時攻擊基因組上的許多部位，會使得自我毀滅機制啟動，細胞被改造成功，然後它就死掉了。

把經改造後失去 PERV 感染性的胚胎細胞，植入孕母母豬，生下沒有 PERV，有望用於器官移植的小豬。圖／取自 ref 1

像最後一戰（Halo）士官長般如此強悍，經歷全身改造後仍活跳跳的細胞，畢竟極為少數。為了克服此一問題，研究者調配了「雞尾酒」一起餵食細胞，也就是在基因改造同時，再加上p53 inhibitor、pifithrin alpha （PFTa）、basic fibroblast growth factor （bFGF），讓受到劇烈衝擊的細胞能繼續活著，不要想不開自殺。

修正後的作法非常成功，研究團隊終於獲得基因組不含 PERV 的乾淨 FFF3。靠著千辛萬苦後得到的細胞，如今已經培育出 15 位不會表現 PERV 的健康小豬寶寶，直到論文發表之際，最老的已長到 4 個月大。

將豬的器官移植給人，目前離那一天仍為時尚早。不過這回的基因改造豬仍是又一大突破，讓我們離目標更進一步，也讓學界有了更多信心。[4]另一方面論文也指出，採用 CRISPR-Cas9 進行基因改造的同時，搭配這回的反自殺雞尾酒配方，能十分有效地強化編輯效率，增加成功率，未來或許有很寬廣的發展空間。

參考文獻：

Advances in organ transplant from pigs
Niu, D., Wei, H. J., Lin, L., George, H., Wang, T., Lee, I. H., … & Lesha, E. (2017). Inactivation of porcine endogenous retrovirus in pigs using CRISPR-Cas9. Science, 357(6357), 1303-1307.
Yang, L., Güell, M., Niu, D., George, H., Lesha, E., Grishin, D., … & Cortazio, R. (2015). Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs). Science, 350(6264), 1101-1104.4.
Scientists grow bullish on pig-to-human transplants

本文亦刊載於作者部落格《盲眼的尼安德塔石匠》暨其 facebook 同名專頁。