何謂雷射掃描共軛焦顯微鏡？

本文轉載自顯微觀點

顯微鏡在觀察微小物體上發揮非常重要的作用，但傳統光學顯微鏡通常愈將倍率放大，景深就愈淺，在觀察立體的生物標本或是組織切片，觀察者無論怎樣調焦，依然無法獲得完全清晰的圖片。數位顯微鏡便能解決這樣的問題。

數位顯微鏡和光學顯微鏡最大的差異在於觀察方式。數位顯微鏡不像傳統顯微鏡透過目鏡來觀察，而是使用數位相機獲取畫面，再將即時畫面投影到連接的電腦螢幕。

三要件組成數位顯微鏡

數位顯微鏡結合了傳統光學顯微鏡、數位多媒體和數位處理技術，其成像系統通常包括三個模組：顯微鏡光學模組、資料擷取模組、數位影像處理和軟體控制模組。

顯微鏡光學模組執行顯微成像的功能，將欲觀察的樣本影像聚焦。一旦聚焦，資料擷取模組就會將影像以數位格式儲存在感光元件，如 CCD（電荷耦合裝置‍）或 CMOS‍（互補式金氧半導體），再透過 USB 或其他介面傳輸到電腦儲存裝置。

軟體控制模組則是整個數位顯微鏡系統的核心，可即時控制、優化擷取的影像，並加以處理、分析測量。尤其隨著功能更強大的電腦出現，數位顯微影像可以得到更有效和高效的處理，例如可以取代手動計數功能，或是快速推疊或拼接影像。

D_tot 表示景深，λ 是照明光的波長，n 是物鏡至觀察物體間介質的折射率，NA 是物鏡的數值孔徑

e 是放置在顯微鏡物鏡圖像中，可分辨的最小距離，M 是橫向總放大倍率

從公式可以看到，景深和總放大倍率幾乎成反比。而以過去難以同時兼備的高倍率和大景深來說，使用顯微鏡調整焦點，搜尋並到達分佈在不同深度的樣本後，再以數位成像設備捕捉分佈在這些深度的所有清晰影像，傳輸到電腦就能產生高品質、清晰的影像。

另外，也可結合雷射和共軛焦顯微鏡觀察不同深度的橫斷切面影像，再利用電腦影像處理和 3D 重建演算法，便能可以獲得高解析度的立體輪廓，進而觀察複雜的細胞骨架、染色體、細胞器和細胞膜。

數位顯微鏡的電腦即時處理也常應用在動態或活體（in vivo）檢測的研究中，例如細胞膜潛在變化、藥物進入組織或細胞膜的過程等。

數位顯微鏡的倍率計算

傳統顯微鏡的總放大倍率為目鏡倍率 x 物鏡倍率，既然數位顯微鏡拿掉了目鏡改以數位相機、電腦取代，該如何計算總放大倍率呢？

數位顯微鏡除了光學放大倍率，還必須考慮數位放大倍率，因此總放大倍率＝光學放大倍率 x 數位放大倍率

• 光學放大倍率：物鏡放大倍率 x C 型轉接環放大倍率

由於連接顯微鏡和相機通常有一個 C 型轉接環（C-mount），且內建鏡頭。因此必須先將物鏡放大倍率乘以轉接環的放大倍率。

• 數位放大倍率＝螢幕（顯示器）尺寸／感光元件尺寸

數位放大倍率必須考慮的元素有螢幕和感光元件。通常螢幕的對角線尺寸以英吋為單位，因此必須先將測量值轉換為毫米（mm）；以 19 吋顯示器為例，其對角線測量值則為 19 吋 x 25.4＝482.6 （mm）。

感光元件尺寸同樣以對角線的測量值來計算。以 1” 的晶片來說，其對角線測量值為 16（mm）。

因此若以 10X 的物鏡搭配 0.67X 的 C 型轉接環，變焦 5X 後使用 2/3”CMOS 攝錄器拍攝並投影在 24 吋螢幕上。此時總放大倍率為：10 X 0.67 X 5 X 24 X 25.4 / 11 = 1856.5 （倍）

不過，隨著技術的不斷進步，數位顯微鏡和光學顯微鏡間的界限變得越來越模糊，有些數位顯微鏡採用更多光學元件，光學顯微鏡也採用了數位相機技術；相信打破藩籬的那一天指日可待。

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參考資料

1. Digital vs. Optical Microscopes: An In-Depth Comparison
2. How to Calculate Microscope On-Screen Magnification
3. Chen, X., Zheng, B., & Liu, H. (2011). Optical and digital microscopic imaging techniques and applications in pathology. Analytical cellular pathology (Amsterdam), 34(1-2), 5–18.

• 本文轉載自科技大觀園，原文為《近場光學顯微術，開啟奈米世界大門》
• 作者／簡靖航｜科技大觀園特約編輯

傳統光學顯微技術發展幾個世紀之後，從 20 世紀後半⾄今，突破光學繞射極限成為顯微技術的重要課題。繞射極限是光波所能聚焦的最⼩尺寸（約為光波長的⼀半，以可⾒光來說約 200-350 nm），仍遠⼤於分⼦和奈米材料。顯微鏡的發明是進入微觀世界的⾥程碑，⽽突破光學繞射極限後就能開啟進入奈米世界的可能性。 

突破光學繞射極限的超⾼解析度顯微技術⼤致上可以分為遠場（far field）與近場（near field）兩⼤類，這兩者的差別在於是否利⽤探針在靠近樣品距離遠⼩於⼀個波長（約數⼗奈米）處進⾏量測，若有則為近場，其餘則屬於遠場。⽽遠場顯微技術若要達到奈米級別的超⾼解析度， 需要以特殊螢光標定加上大量電腦計算來輔助。 

中央研究院應⽤科學研究中⼼研究員陳祺，專攻近場光學顯微術，屬於探針掃描顯微術（Scanning probe microscopy, SPM）中與光學相結合的分⽀。 

探針掃描顯微術，家族成員眾多 

探針掃描顯微術泛指使⽤探針來掃描樣品的顯微技術，依照原理的差別再細分成多個類別。在整個探針掃描顯微術家族中，最早的成員為 1981 年問世的掃描穿隧顯微鏡（Scanning tunneling microscope, STM），其主要機制是偵測探針與待測物表⾯間的量⼦穿隧電流（註1），作為回饋訊號來控制針尖與待測物的距離，⽽得到待測物表⾯次原⼦級別的高低起伏。1986 年發明的原⼦⼒顯微鏡（Atomic force microscope, AFM）則是⽬前最廣為應⽤的探針顯微技術，其以針尖接觸（contact）或輕敲（tapping）物體，藉由偵測針尖和物體表⾯間之凡得瓦⼒，得知物體表⾯的高低起伏。 

在探針掃描顯微術中，控制針尖與物體的相對距離是重要的課題，STM 可控制距離在一奈米以下，AFM 則可在一奈米到數十奈米間變化。此外，要在奈米世界「移動」並不是⼀件簡單的事。因為⼀般以機械⽅式的「移動」，其尺度都會在微米級別以上，這就像是我們沒有辦法要求⼤象邁出螞蟻的⼀⼩步⼀樣。所幸 1880 年居禮兄弟發現壓電材料會因為外加電場，⽽導致晶格長度的伸長或者收縮，即可造成奈米級別的「移動」。⽬前所有的探針顯微術都是以壓電效應達成對針尖或樣品「移動」的控制。 

近場光學顯微術，探針加上光 

依 STM/AFM 控制針尖的技術基礎，外加光源於針尖上，即為近場光學顯微術（Scanning near-field optical microscopy, SNOM），依照光源形式的不同可區分為兩⼤類： 

1. 微孔式近場光學顯微術（aperture SNOM，簡稱 a-SNOM） 
2. 散射式近場光學顯微術（scattering SNOM，簡稱 s-SNOM）

a-SNOM 是利用透明的 AFM 針尖，先鍍上⼀層⾦屬薄膜，並打上⼩洞，讓光從⼤約 50-100nm 左右的⼩洞穿出，得到⼩於光學繞射極限的光訊號。s-SNOM 則是外加雷射光源聚焦於針尖上，並量測散射後的光訊號。其中，針尖增強拉曼散射光譜顯微鏡（Tip-enhanced Raman spectroscopy, TERS）是屬於 s-SNOM 的⼀種特殊近場光學模式，主要為量測拉曼散射光譜，即可識別分⼦鍵結的種類。由於拉曼訊號相對微弱，透過探針鍍上⾦屬薄膜，即可利⽤針尖端局域電場的放⼤效果，來增強待測物的拉曼訊號，並利用針尖的移動來得到奈米級空間解析度的拉曼成像。 

陳祺的研究歷程與觀點

在陳祺就讀博士期間，其研究領域主要為結合低溫超高真空 STM 的單分子光學量測，需要極度精進探針掃描顯微鏡的穩定與解析度。畢業之後將⽬標轉向室溫室壓下的探針掃描顯微術與光學的結合，用以量測更多種類和不導電樣品。

陳祺在博⼠後期間的⼯作以 TERS 為主，曾發表解析度⾼達 2 奈米以下的成果，維基百科的 TERS 條⽬，也引⽤了陳祺當時發表在《Nature Communication》的論⽂。回國進入中研院之後，陳祺也開始 a-SNOM 的研究。

無論 TERS 或 a-SNOM，兩者的實驗設計都是建構在 AFM 上，因此陳祺會⾃⾏架設更精準的 AFM，以達成近場光學顯微術更佳的穩定性。 

近場光學實驗操作上的困難除了針尖的製作之外，穩定的 AFM 掃描其實也相當不容易，是維持針尖品質的關鍵。傳統上 a-SNOM 都是以接觸式（contact mode）的 AFM 方式掃描，以防止輕敲式（tapping mode）起伏會干擾光訊號，代價就是 AFM 的解析度極差。陳祺將⾃架的近場光學實驗放進⼿套箱裡，能讓針尖在輕敲式時維持極⼩的振幅（在⼀個奈米以下），可以大幅提高 AFM 的形貌解析度，也幾乎不損傷針尖。由於陳祺有非常豐富⾃架儀器的經驗，才能很⼤程度突破⼀般商⽤儀器的限制。 

⼀般認為 TERS 有較佳的解析度，但由於 TERS 在散射訊號影像上有很大程度的不確定性，經常導致假訊號或假解析度的發生。近年來陳祺反⽽把研究的主軸轉向 a-SNOM，因為她更看重是否能由 AFM 得到的材料結構和高度，來解釋近場光學所量測的結果，以期研究材料背後的物理或化學現象。

另外，陳祺近期最重要的突破是在⽔中完成 a-SNOM 的量測，將針尖與光學元件整合在自製的腔體（cage system）之中，得以在保持生物樣品的活性之下得到超高解析度的影像，這將是開啟利用近場光學研究⽣物課題的重要⾥程碑。

最後，⾝為擁有兩個孩⼦的女性研究員，「如何兼顧⼯作與家庭」或許是⼀般新聞媒體會問的問題。然⽽，陳祺分享⾃⼰的⼼得：「是不可能兼顧的啦！先集中精神做好⼀件事，等另⼀件要爆掉的時候再去救它。」可能坦承⾃⼰沒有辦法做好每件事， 反⽽讓陳祺在實驗上永遠能找到促使⾃⼰改進的動⼒。 

註解

註 1：量⼦穿隧電流：在量⼦世界中，物質同時具有波動和粒⼦的特性。因具有波動的性質， 當電⼦撞擊⼀層很薄的障礙物時，有不為零的機率穿過去，並產⽣穿隧電流（tunneling current ）。穿隧電流與障礙物厚度成指數函數遞減，因此可藉由量測穿隧電流強度計算出待測物表⾯極微⼩的⾼低起伏。

• 作者｜理查．馬斯蘭（Richard Masland）
• 譯者｜鄧子衿

一個男人彎腰抱著吉他
修剪草木的人，那天是綠色的。
世人說：你有一把藍色吉他
你彈奏得不像樣。
他回答：曲子就是那樣
在藍色的吉他上彈才變樣。——華萊士．史蒂文斯

強化真實世界影像

視網膜細胞一開始處理的另一件重要的事，是強化輸出影像的邊緣。請注意開啟細胞和關閉細胞並沒有改變視覺影像，只是告訴腦接收到的是明亮或是黑暗。邊緣強化是另一回事，因為從這裡開始，原始的影像就沒有忠實地傳遞到腦部了。就腦部那邊來看，影像已經受到強化了，也就是邊緣受到處理，具備了最多的資訊。

邊緣的重要性看起來非常明顯，但是其中包含了一個掌握了視覺非常多面向的核心原理。自然世界呈現出來的像素絕對不是隨機的，自然的影像世界中具有結構：線條、角度、曲線、表面。也就是說，有些像素的出現會受到周遭影像內容的影響。真正的隨機影像世界像是只收到雜訊的電視螢幕。人類的視覺系統能夠加以整理，強化發生改變的結構，並且削弱缺乏變化的區域，例如天空的中央，單一顏色區塊的內部。

視網膜產生讓影像邊緣強化的機制是「側邊抑制」（lateral inhibition），這是視網膜所進行的基本程序之一，也是電腦影像生成的基本程序。這時我們再一次去看剛才那個簡單的圖案，那個全黑和全白的區域中沒有什麼資訊，產生變化的點（也就是邊緣）才有最多的資訊。側邊抑制會使得靠近邊緣的節細胞的反應增強。也因為邊緣抑制，腦部接收到的黑色邊緣和白色邊緣的訊息最為強烈。這是視網膜選擇影像世界中重要特徵傳遞給腦部的根本例子。

在行動電話和電腦中也有相同的數位邊緣強化程式。你大概知道數位影像通常都可以用「促進對比」或「邊緣強化」修改。修改後影像會變得更為銳利。當然，天下沒有白吃的午餐，影像中的灰色調往往犧牲了，但是有的時候這個犧牲是值得的。

看到的都是修改過的影像

側邊抑制這個機制普遍存在於感覺系統中，視覺、觸覺和聽覺有，嗅覺和味覺可能也有。所有哺乳動物和許多脊椎動物都具備側邊抑制，這個系統可能很有用，在動物演化初期便出現了，是大自然最早的影像處理技巧。側邊抑制（邊緣強化）為什麼這麼好用呢？

要回答這個問題，我們得把側邊抑制當成視網膜上所有視網膜節細胞所送出訊息的特性。下面這張圖指出了落在視網膜表面上的正確影像（由桿細胞和錐細胞所偵測），在經由幾個步驟的修改之後，由視網膜節細胞送往腦部。

上面那條線代表視覺影像，影像的一半是黑色的，另一半是白色的。中間的那條線代表了由一片視網膜節細胞看到的影像。最下面的那條線代表了節細胞送往腦部的訊息強度。請注意在邊緣地區，由每個節細胞傳遞的訊息是經過強化的，在亮的區域那邊增強了，而在暗的那邊節細胞的反應減弱了。從腦來說，這個機制產生的效果是亮和暗之間的差異（定義出邊緣的訊號）增加了。

為了讓說明簡單，我在這裡用只含有開啟細胞的視網膜當例子，其實另一半的關閉節細胞也有發揮作用，方式是和開啟細胞相反，但是效果相同：增加邊緣附近訊號的差異。我在這裡不會囉嗦說明每個步驟，他們其實就像是開啟細胞，只是行為反過來而已。

為了好玩，我們可以思考一個有趣的事情：如果造成刺激區域的黑色是最黑的黑色，白色則是完全的純白色，那麼黑色的邊緣會看起來更黑、白色的邊緣會看起來更白嗎？如果造成刺激的黑色是純黑，白色是純白，那麼就定義上來說，由開啟細胞組成的系統和關閉細胞組成的系統應該會受到限制，因為他們的反應不可能在零之下，也不會超過百分之百。但是在現實世界中，一個影像的所有部位都會當成是在零與百分之百之間，會比較亮或比較暗，但不會是絕對的亮與暗。當視覺系統遇到從亮到暗的轉變區域時，側邊抑制會用同樣的方式強化訊號，讓我們對於對比的感知更為強烈。這個機制造成了著名的視覺錯覺「馬赫帶」（Mach bands）：深淺不同的兩條色帶並在一起時，我們會覺得交界處旁邊深色的區域的顏色要比較深、淺色區域的顏色要比較淺。

總而言之，視網膜上的視網膜節細胞有四種基本形式：暫時開啟、持續開啟、暫時關閉、持續關閉，每一種都會受到側邊抑制的影響，所以對於邊緣附近區域產生的反應要比中央沒有變化的區域來得強烈。我們在第四章中還會看到，視網膜其實更為複雜，就如同一篇論文的標題中所說的，「比科學家所想得還要聰明」。但是我們可能要一段時間才發現到有多聰明。在此同時，科技進展讓我們能夠更仔細腦部處理來自視網膜資訊的方式。

還記得去年清大江安世教授利用共軛焦顯微鏡建構出果蠅「腦內嗅覺神經網路地圖」，今天小編就簡易的寫一篇何謂雷射掃描共軛焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscopy ，簡稱LSCM）

雷射掃描共軛焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscopy ，簡稱LSCM）是近代生物醫學影像儀器的最重要發展之一，它是在螢光顯微雷射掃描裝置，使用紫外光或可見光激發螢光探針，利用電腦進行影像處理，從而得到細胞或組織內部微細結構的螢光影像，以及在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態的變化。已廣泛應用於細胞生物學、生理學…，有時也被稱為雷射掃描細胞儀（Laser Scanning Cytometer，LSC）是八十年代迅速發展起來的用於分析細胞學的新型儀器。LSCM與普通光學顯微鏡相比優點明顯，分辨率、靈敏度、放大率和螢光檢測信噪比大大提高。對活細胞可以做分層掃描後，進行3D重建和測量分析，對細胞內微細結構的動態變化…

雷射掃描共軛焦顯微鏡的發展

科學研究工作對更高影像分辨率的追求產生了雷射掃描共軛焦顯微鏡。隨著免疫螢光技術在生物學研究領域的廣泛應用，研究人員注意到，螢光顯微顯微鏡使用場光源，因標本鄰近結構（細胞或亞細胞結構）產生的衍射光和散射光的干擾，使標本中細微結構的成像不夠清晰。

一. 組成
倒置或正立螢光顯微鏡、掃描頭(照明針孔、探測針孔、螢光濾片系統、鏡掃描系統和光電倍增管)、掃描頭控制電路、電腦和影像輸出設備

二. 原理
利用放置在光源後的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現點照明和點探測，來自光源的光通過照明針孔發射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發射的螢光成像在探測針孔上，該點以外的任何發射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即共焦點，被探測點所在的平面即共焦平面。電腦以像點的方式將被探測點顯示在電腦螢幕上，為了產生一幅完整的影像，由光路中的掃描系統在樣品焦平面上掃描，從而產生一幅完整的共焦影像。只要載物台沿著Z軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動，就可得到樣品不同層面連續的光切影像。

在共軛焦顯微鏡的價格都是幾百萬台幣以上，因為非常精密所以價格不斐。

前一陣子工研院光電所已經有做出一台簡易式的共軛焦顯微鏡，小編已經測試過囉！當然精密度無法像正常一樣，但用來教學或用於較大型的物體還可堪用，售價小編記得大約在五十萬左右吧！

原文出處：Photomicrography can also be an art!