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改造開源機器手臂meArm〈硬體篇〉

馥林文化_96
・2015/08/17 ・2533字 ・閱讀時間約 5 分鐘 ・SR值 548 ・八年級
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文/位明先(技職教育老師)、胡哲瑋(機器人設計工程師)

近年來臺灣的自造者運動漸趨活躍,而在熱情的高雄港都也有一群自造者們會不定期舉辦活動聚會。在一次的因緣際會中,因為我們同時對開放原始碼設計的meArm 機器手臂感到興趣,因此開始合作一同製作這個meArm 機器手臂。由於meArm 採開放式設計, 所以不管任何人都可以在網路上找到它的設計檔,其結構非常簡單,配上現今多元的結構製作方式, 如果再搭配Arduino 控制器, 便可當作機器手臂的實驗器材。但在實際使用後,仍有許多需要改善的空間。

像是組成結構的零件是將螺絲與壓克力直接絞合,鎖得太鬆會讓手臂在移動時產生晃動, 太緊則容易卡死。不只是難以調整,當使用一段時間之後,壓克力上的螺紋也容易磨損使螺絲滑牙。下方轉動底盤的穩定度也不佳,當手臂伸長後會傾斜變得不易轉動。此外,夾爪在夾取物品的設計上仍需改良, 原先所用之SG-90 伺服機扭力過低,種種問題都會使手臂的應用範圍受到限制。因此經過一番討論後,我們決定分別負責機構的改善以及電控的設計,再邀請葛士冬同學分擔製作的工作, 就這樣開始進行meArm 的改造專題(照片1)。

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(照片1) 改造後的meArm 機器手臂。

改善機構

若要讓機器手臂能用得更久, 首先要改善鬆散的結構,我們在原本壓克力骨架的連接處, 加裝垂直連接件(照片2),用螺絲直接鎖在結構上(照片3),以提高結構強度與穩定度。
原來機構上的活動關節則改用自鎖螺帽,以便之後進行旋緊或放鬆的調整,保留零件的連接公差(照片4)。同時因為壓克力不用再負擔螺絲的應力,也不會在長時間的使用後產生滑牙的問題。不過在修改時需注意原本鎖螺絲的孔, 其孔徑大小要再加大3mm ,才能讓螺絲順利穿過。

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(照片2) 垂直連接件。(照片3) 用螺絲鎖好結構。(照片4) 活動關節則改用自鎖螺帽,以便之後進行旋緊或放鬆的調整。

迴轉底盤的部分則著重於增加轉動的穩定度,並加強前移與抬升機構的進程,讓手臂伸展到極限時,仍能維持順暢的動作(照片5、照片6)。

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(照片5) 迴轉底盤。(照片6) 迴轉底盤。

原本的夾爪馬達有效角度大約只有30 度,一旦轉動超過其限制便會卡住無法轉動,對馬達造成損傷。再者,若只用USB 來供電, 也會導致USB 電源保護斷電。便決定將夾爪連桿結構重新設計以便解決這個問題(照片7),不僅增加轉動的角度,也不會再有卡死的情況出現。同時我們也針對驅動夾爪的齒輪組做了些更動,藉由改變齒輪的形狀,增加整個轉動過程中齒輪咬合的面積,讓動作更穩定且不晃動,也可以減少夾取物體時的間隙。

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(照片7)  防鎖死夾爪。

建議使用CNC 雕刻機進行加工,能進一步減少齒輪間隙的公差,讓夾爪的動作更精確。
最後,則是使用扭力更強的伺服機(GS-9025MG)(照片8),同時使用外加直流電源供應,確保在伸長手臂之後,還能有足夠的抬升力量,也不會因為馬達負載電流過大造成USB 自動斷電。

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(照片8) GS-9025MG 伺服機。

改造伺服機

改良機器手臂後,接著就能開始加上學習(Self Learning) 功能, 讓指導者能直接抓著手臂移動來記錄動作,再讓手臂重複做出一模一樣的動作。要達成此功能,必須將一連串的伺服機位置資料記錄在記憶體中。等到要重播動作時,再將資料取出來,好讓伺服機得以依照順序來移動。

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若要取得伺服機的位置資料,除了可選擇同步外接角度感測器外,比較簡便的方法則是取出伺服機內部可變電阻的電壓值,再透過Arduino 的類比數位轉換功能,將取得的電壓值轉換成角度。不過, 要取得伺服機的VR 電壓就則必須改造在伺服機的內部稍作修改。首先將伺服機外殼固定螺絲轉拆開(照片9),接著並從在控制電路板上面找到VR 可變電阻的3 個接點(分別是電源、接地與VR 電壓)。

一般來說,仔細觀察電路板便可以發現很容易可以找到這3 個接點,焊點比較大的就是了;而在排在中間的點,通常就是VR 代表的電壓接點腳。如果要再進一步確認,可以將伺服機接上電源,再利用以數位三用電表測量接點與接地點端的電壓,如果轉動伺服機時,電壓會隨著成依比例改變,那麼這個接點即為電壓接腳。

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(照片9) 將伺服機外殼固定螺絲轉拆開。

用烙鐵將一條導線焊到電壓接腳上(照片10),便能取得馬達轉動時的電壓變化。不過,還得要在外殼上鑽一個小孔讓導線通過外殼(請依所用導線粗細來選擇鑽孔大小)(照片11)。最後將改造過後的伺服機裝到手臂上(照片12、照片13)。

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(照片10) 將導線焊到電壓接腳上。(照片11) 在外殼上鑽一個小孔讓導線通過。

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(照片12) 改造完成的伺服機。(照片13) 將改造過後的伺服機裝到手臂上。

取得電壓後, 將伺服機接上電源,再將電壓輸出端接到Arduino 的類比數位轉換腳位上(照片14)。經實際的測量,伺服機由0 度轉動到180 度時, 其數值則會由117 變化到557。因此,可推得兩者的轉移函數為:

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角度=((AD轉換值-117)*180)/440

這樣就能得到伺服機相對應的位置資料了。

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(照片14) 取得電壓後連接到AD 轉換輸入。

學習功能的另一個關鍵則是要把設定好的手臂位置儲存起來,以便教導手臂後可反覆取出,控制手臂的動作。Arduino 可使用SD 卡或內部的EEPROM 來儲存資料,為了方便,我們使用了I2C 介面的EEPROM 當作儲存元件,因為它可以在電源拔取後移給另一個手臂讀取同樣的動作,價格也比SD 卡便宜。硬體的改造就到此告一段落,下次會針對電路與程式設計的部分做介紹。

文章原文刊載於《ROBOCON》國際中文版2015/9月號

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馥林文化_96
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馥林文化是由泰電電業股份有限公司於2002年成立的出版部門,有鑒於21世紀將是數位、科技、人文融合互動的世代,馥林亦出版科技機械類雜誌及相關書籍。馥林文化出版書籍http://www.fullon.com.tw/

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臺灣的水真的沒辦法生飲嗎?
鳥苷三磷酸 (PanSci Promo)_96
・2024/09/13 ・6474字 ・閱讀時間約 13 分鐘

本文由 Amway 委託,泛科學企劃執行。 

根據衛福部建議,我國成人每天應該飲用約1500至2000 c.c. 的水,但在日本與歐美許多國家,只要一打開水龍頭,就能馬上擁有一杯能喝下肚的水。臺灣自詡為科技大國,為什麼卻無法擁有讓人安心的 Tap water?

冤有頭債有主,造成我們不敢生飲水的最大原因,其實不在自來水廠。從自來水廠出來的自來水,早已去除水源中的化學有機污染物、有害重金屬及致病性微生物,完全符合「飲用水水質標準」。在非常嚴密的檢驗和監控下,照理來說,你我都能夠非常安心的直接飲用這些自來水。然而,就連對水質信心滿滿的自來水廠,也大力呼籲民眾「不要直接飲用自來水」,這是怎麼一回事?

圖片來源:shutterstock

從水廠到家裡的自來水會經過哪些污染源?

首先,是管線老舊。不只是老舊管線內壁會積聚沉澱物和生物膜,管線本身若有生鏽、腐蝕的情形,還會在水中增加的鐵鏽和金屬離子。

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臺灣管線老舊的程度到底有多嚴重呢?根據台水公司108年的資料顯示,我國自來水管線長度超過6萬3千公里,其中超過48%的管線已經超過使用年限。再加上施工、地震、車輛超載等原因,使得管線容易破裂、漏水,進而影響水質。

除了管線品質外,蓄水池與水塔的清潔和維護也是影響自來水品質的重要因素。根據環境部指出,有高達7成以上的自來水污染事件,都是因為住戶疏忽清洗水塔的重要性,導致細菌和泥沙在儲水設施中繁衍和沉積。然而,超過45%的台灣民眾沒有定期清洗蓄水池和水塔的習慣。

這邊也要特別提醒,管線破損與蓄水池的污染,不只會讓飲用水再次受到重金屬與細菌的污染,更讓我們需要當心「新興污染物」的威脅。

什麼是「新興污染物」?

所謂新興污染物,指的是那些對環境有潛在威脅,但還沒有受到國家或國際法律廣泛監管的化學物質總稱。他們來自各種日常化工用品,並且透過城市、工業、家庭廢水進入河川與水體中。

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根據聯合國環境署的說明,「符合新興污染物資格的化合物清單很長,而且越來越長」。這些污染物其實離我們並不遠,是我們周遭常見的物質,例如抗生素、止痛藥、消炎藥、類固醇和荷爾蒙等藥物類,驅蟲劑、微塑膠、防腐劑、殺蟲劑、除草劑等環境荷爾蒙類,還有工業化學類的界面活性劑、火焰阻燃劑、工業添加劑、汽油添加劑、PFAS、鐵氟龍等等。

其中的全氟及多氟烷基物質PFAS,因為耐腐蝕、抗高溫,在自然環境中幾乎無法分解,又被稱為「永久性化學物質」。容易在環境及人體內累積,具有生物累積和生物放大性。而且PFAS衍伸的化合物超過一萬種,在防水、防油的紙袋、紡織品、化妝品中都很常看到。

PFAS成員全氟辛酸PFOA在2023年,被聯合國的國際癌症研究機構IARC,從2B級「可能對人類致癌」提升為一級「充分證據顯示對人類致癌」。另一個成員全氟辛烷磺酸PFOS則列為2B級致癌物。而環境部也在2024年,更針對PFOA、PFOS訂定飲用水濃度指引值。

PFOA 已被列入 IARC 第1類致癌物質,圖:Wikipedia

麻煩的是,這些新興污染物在都市中大多還未納入常規監測項目,我們對於他們對環境與人體的影響也還未全盤了解。甚至很多污染物,可能是十年前都還沒出現的。我們也不知道十年後,新興污染物的名單上,還會增加哪些名字。我們能做的事,就是盡量避免再避免。而徹底解決管線破損,與城市污水滲入蓄水池的可能性,我們才能避免這些新興污染物,進入到我們的飲用水中。

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使用淨水器過濾,會是淨化水質更好的方法嗎?

淨水器比起單純加熱煮沸,裡面包含了許多科技結晶,確實可以一口氣解決所有問題。但相對的,材料的選用與設計,就會更直接影響水質的好壞。

例如今天要介紹的eSpring益之源淨水器Pro,裡面用的濾材,是很常聽見的「活性碳」。

活性碳的作用是「過濾」,就像麵粉通過篩網,可以篩掉較大的顆粒。活性碳的製備,很多來自木材、椰子殼等高碳含量的原料。在經過高溫碳化,並通過活化劑或化學藥劑處理之後,會形成多孔結構,這些不規則的微小孔隙可以有效過濾水中的污染物。然而,活性碳的作用遠不止如此!其實,活性碳的過濾原理是「吸附」雜質。

活性碳是常見的濾材,圖:Wikipedia

有研究透過光譜和密度泛函理論(DFT)分析顯示,活性碳表面的含氧官能團,如羧基(carboxyl groups)和酚基(phenol groups),能夠與鉛離子(Pb(II))形成穩定的化合物,達到淨水的效果。這意味著活性碳能有效吸附和去除水中的重金屬,如鉛、銅、汞等重金屬,從而保證飲用水的安全性。

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也就是說,活性碳不僅通過物理吸附去除水中的懸浮物和大分子,還可以通過化學吸附來處理更複雜的污染物。除了重金屬以外,眾多的有機物、臭味分子甚至是餘氯,也都在活性碳的守備範圍內。一篇發表在《Reviews in Chemical Engineering》的論文也指出,面對日益增加的新興污染物,活性碳也正是一種具有前景的選擇之一,尤其農藥、個人保健與衛生藥(PPCPs)以及內分泌干擾物質(EDC)與活性碳有很強的吸附性,能有效的過濾這些新興污染物。

更進一步,科學家們正在研究各種農業廢棄物和不同的活化方式。他們發現,透過不同的原料和活化方式,活性碳表面官能基和結構的差異可以提高對不同污染物的吸附能力。例如,當使用鷹嘴豆、甜菜甘蔗渣或咖啡渣作為前驅物時,這些活性碳材料展現出對銅離子、鉻離子、染料及其他重金屬和有機污染物的優異吸附能力。

接下來,如果你的淨水器功能只有過濾,能確保的只有有機物與重金屬的去除,細菌可能還是存在。

當我們談論淨水器的功能時,許多人誤以為只要經過過濾就能確保水質的安全。實際上,這樣的理解並不全面。如果淨水器的功能僅限於過濾,它能確保的只有去除水中的有機物質和重金屬,然而,過濾並不能消除所有細菌,因此水中的微生物仍然可能殘留。這就是為什麼,即便過濾器

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之外,還需要強效殺菌來進一步保證水質。

紫外線是我們日常生活中常見且高效的殺菌工具,從居家用的烘碗機到手術室、圖書館的空氣或表面消毒,紫外線技術的應用無所不在。在淨水系統中,特別是UV-C 紫外線(波長範圍100-280nm)被證明能夠有效殺滅水中的微生物。許多先進的淨水器配備 UV-C LED ,這種燈能夠針對細菌、病毒進行消毒。

圖片來源:Amway

怎樣算是一個合格的淨水器?

美國國家衛生基金會(NSF)制定了一系列針對淨水器的性能、安全性和耐用性的標準,稱為NSF/ANSI標準。

針對台灣飲用水可能遇到的問題:細菌、重金屬、新興污染物、餘氯,各有專門的訂定標準。

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NSF/ANSI 標準指的是美國國家科學基金會下美國國家標準協會的所訂定的標準,

eSpring益之源淨水器Pro通過的第一跟二項標準是NSF/ANSI 53和401標準,53項針對的是健康相關的污染物,包含重金屬如鉛、銅、汞等有害金屬離子,還包括一些有機污染物如揮發性有機化合物(VOCs)。401項則是針對來自農藥、藥物等新興的有機污染物,因為在傳統的水處理過程中難以去除,因此特別訂定。

第三項,則是針對UV-C LED紫外線滅菌艙殺菌效果的NSF/ANSI 55標準。這個標準不僅規定了紫外線強度,還包括了水流量和微生物減少效果的測試與持久性,確保淨水器具有足夠的殺菌消毒能力。根據實驗數據,UV-C  LED紫外線能夠有效消滅高達99.9999% 的細菌,99.99% 的病毒,以及99.9% 的囊胞菌,為飲用水提供極高的安全保障。

最後一項標準是NSF/ANSI 42,他針對的餘氯和其他會影響味道與氣味的雜質。也就是像eSpring益之源淨水器Pro有通過第42項標準的,在確保飲用安全的標準之上,還能讓你的水更好喝哦。

這邊也要補充,除了第42、53、以及401項規定的標準,eSpring益之源淨水器Pro還請NSF做了標準之外的各項過濾性能檢測,總共有超過170種污染物的過濾符合標準,包含各種化學物質、重金屬、生物性、農藥、藥物、甚至是近年大家關注的石綿、氡氣與塑膠微粒,都在可被有效過濾的列表之中。這真的很重要,如同一開始我們講的,隨著工業文明的發展,新興污染物的名單只會越來越長而不會減少,多做幾項檢測,絕對是更安心的。如果你的淨水器已經用了很久,但擔心新興污染物沒有在獵捕名單內,可以考慮換成有通過更高標準的淨水器哦。

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另外,一些品牌雖然也有NSF認證,但很多都只有零件認證。eSpring益之源淨水器Pro不只針對濾心,還通過「全機認證」,確保從淨水器流出來的每一滴水都符合標準。

進一步了解商品: eSpring益之源淨水器Pro

參考資料:

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鳥苷三磷酸 (PanSci Promo)_96
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時間與空間的顛覆!如何用簡單的方式了解「相對論」?——《物理角色圖鑑》
azothbooks_96
・2024/09/16 ・2086字 ・閱讀時間約 4 分鐘

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時間不再絕對?牛頓與愛因斯坦的時間觀差異

川村老師,請用簡單的方式告訴我「相對論」是什麼?

圖/《物理角色圖鑑》

老師:狹義相對論源自相對性原理(Principle of relativity,指物理定律〔Physical law〕適用於所有以等速直線運動的物體) 與光速恆定原理。根據這個理論,時間是相對的,依不同觀察者而有所差異。牛頓力學中的時間是絕對的,愛因斯坦則認為,可依不同的觀察者位置對時間進行不同定義。

圖/《物理角色圖鑑》

老師:之前在討論「力」時,也提過離心力。離心力是「慣性力」的一種,慣性力指物體在加速運動時感受到的與加速方向相反的力。置身在沒有窗戶的電梯中,當電梯向上加速,電梯內的人會受到向下的慣性力(譯注:因看不到外面,使得他無法判斷電梯的運動情況)。若加速度為 g,物體質量為 m,則物體所受慣性力為 mg,與在地面所受的重力 mg 相同。愛因斯坦無法區別這兩種 mg 的差異,所以視為等效。但無論慣性力的方向為何,物體都會往向量合成後的視重力場方向掉落。

時間在任何地方都固定不變嗎?

世界上最快的速度是光速。物體的移動速度若接近光速,它的時間進程就會變慢。也就是說,在接近光速的太空船上,時間會變得悠長。而且,接近光速的物體長度會朝行進方向收縮。

物體只要具有質量,即使在靜止狀態依然擁有能量(其能量 E mc2,稱為靜止能量(Rest energy)。

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提到光的運動,我們已經知道光的路徑會彎曲。

1919 年,天文學家觀測到恆星發出的光線在經過太陽附近時被偏折,這種現象稱為「重力透鏡效應」(Gravitational lens),有助於了解黑洞等宇宙中質量分布的情況。此外,天體物理學家也觀測到時間的延遲。簡而言之,接近地面的時鐘行進速度會比高處的時鐘慢,GPS 也是依據這種效應來進行校正。

圖/《物理角色圖鑑》
圖/《物理角色圖鑑》

時間

牛頓力學中的「時間」(也就是我們一般理解的時間)和相對論中的時間大異其趣。牛頓在《自然哲學的數學原理》(Philosophiæ Naturalis Principia Mathematica,1687)中,假設空間是均勻平坦的;從過去到未來,在任何地方都平均延伸。在牛頓力學中,全宇宙的時間一致。

但相對論否定了這一點。

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圖/《物理角色圖鑑》

光速恆定原理指出,光的速度是固定不變的。這種狀況下,空間中不同地點發生的兩件事,對某個觀測者來說是同時發生,但對另一參考系的觀測者而言則非同時發生。也就是說,時間的前進速度並非在任何地方都相同。因此,時間和空間不能視為各自獨立的兩回事,應該一體化,視為四維空間(時空,Spacetime)。

不過,這是指物體移動速度接近光速時的情況。日常生活中,使用過去的時間觀不會有任何問題。

黑洞

黑洞(Black hole)是一種天體,因為密度極高,重力極強, 不只物質,連光都會被吸進去,無法逃逸。天體是宇宙中所有物體的總稱,具體來說,指太陽、恆星、行星、星團、星雲等。從相對論來看,黑洞周圍空間是扭曲的。照以下方式想像應該會比較容易理解:

把重物放在一大塊展開的薄橡皮布上,放置處就會凹下去,而這塊凹陷會影響到周圍。同樣的,黑洞所在之處會發生猛烈的空間扭曲,經過附近的天體會被極強的重力吸引,落入其中,連光也難逃魔掌。

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銀河系有許多黑洞,但具體數字不詳。2019 年,一個跨國研究計畫團隊首次拍攝到黑洞的「影子」,掀起一陣討論熱潮。

——本文摘自《物理角色圖鑑:用35個萌角色掌握最重要的物理觀念,秒懂生活中的科普知識》,2024 年 9 月,漫遊者文化,未經同意請勿轉載。

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azothbooks_96
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漫遊也許有原因,卻沒有目的。 漫遊者的原因就是自由。文學、人文、藝術、商業、學習、生活雜學,以及問題解決的實用學,這些都是「漫遊者」的範疇,「漫遊者」希望在其中找到未來的閱讀形式,尋找新的面貌,為出版文化找尋新風景。

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RESI : 基礎儀器定位奈米世界
顯微觀點_96
・2024/09/14 ・3117字 ・閱讀時間約 6 分鐘

本文轉載自顯微觀點

Abstract Of Digital DNA Construction.
圖/顯微觀點

電腦運算是近 20 年來生物影像突破繞射極限的可靠工具,例如 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), PALM(Photo-Activated Localization Microscopy),以電腦記憶、疊合,將多次拍攝的零散螢光重建成完整輿圖,解析度極限可接近 10 奈米。

現在,透過電腦輔助的序列成像解析度增強術(RESI, Resolution Enhancement by Sequential Imaging),科學家能將細胞內分子的定位解析度大幅提升到埃(Ångström, Å.等於1/10奈米)的尺度,清晰定位緊鄰的分子、觀察它們在細胞內的變化。

RESI 定位可呈現 DNA 相鄰鹼基間距,超越超解析顯微鏡,達到與電子顯微鏡同等的解析度,而且只需基本的細胞固定,近乎完全保持樣本原貌。

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在德國馬克斯.普朗克生化研究所率領團隊研發 RESI 的榮曼(Ralf Jungmann)認為,RESI 能填補介於光學顯微術與結構生物學之間的資訊空白,揭露更多複雜生命系統的真相,為分子生物學與藥物動力學開闢道路。

「發光順序」成為解析度新要素

使 RESI 成為「超級超解析」定位術(super-super resolution)的核心概念,是以不同 DNA 螢光探針對目標進行多次標記定位,定位過程由電腦為目標編上號碼(DNA-barcoding),使「發光順序」成為分辨目標的新維度,並以「定位次數」來大幅提升解析度、為量化分析提供充沛樣本。

Cd20
CD20 的分布在 RESI 定位下一覽無遺,透過 RESI 定位可發現,標靶藥物 RTX 使癌細胞表面的 CD20 聚集成鍊狀。圖片來源:Reinhardt et al. Ångström-resolution fluorescence microscopy. Nature 617, 711–716 (2023).

例如,淋巴癌與自體免疫疾病的關鍵標靶:B 細胞表面 CD20 蛋白﹐雖然早已發現是重要的癌細胞特徵,也確認有效藥物,但其結構與分子動力學依然曖昧不明,學界對它的了解還不足以研發進一步療法。

儘管 CD20 蛋白的結構已被電子顯微鏡呈現,但電子顯微鏡的拍攝條件會破壞細胞膜結構,導致 CD20 變形、偏移。現在透過 RESI 進行定位,CD20 的構造、藥物效果,都可以在接近生理狀態下一探究竟。

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在 RES I分析下,榮曼等學者發現 CD20 總是成對出現(as dimers),並且在關鍵藥物 RTX(一種抗 B 細胞的單株抗體)加入後,會在細胞膜上聚集成緊密的長鏈。這些資訊是過往電子顯微鏡與超解析光學顯微鏡都未曾展現的。

序列成像:以次序換取空間

各種超解析單分子定位術的共同難題,是兩個目標分子過於接近,連電腦運算也無法辨別。假使兩個距離 1 至 2 奈米的相同分子輪流被激發,PALM, STORM 等仰賴隨機放光的超解析定位術即使分別收到兩個光源的螢光訊號,重建時也容易將緊密的兩者混為一點。

榮曼也強調,當兩個螢光團的距離小於 10 奈米,近場光學效應會大幅影響光調控螢光染色分子(photoswitchable fluorescent dyes)的表現。分辨兩個距離數奈米甚至數埃(Å)的分子,是單分子定位技術的最後關卡。

面對諾貝爾級超解析技術也無法克服的障礙,RESI 巧妙地以「標記」技術避開了光學難關。RESI 採用進化版本的 DNA-PAINT,螢光探針與目標結合轉瞬即脫落,並能使相鄰的目標結合不同探針,避免兩者同時發光,兩個緊密的分子幾乎不會干擾彼此成像。

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奠基於隨機放光的單分子定位術(SMLM),序列成像(Sequential Imaging)用不同顏色、不同激發光譜的 DNA 螢光探針,標記鄰近的兩個目標,使兩者輪流發光。如此一來,發光順序便成為辨別螢光標記的新方法:兩個目標距離僅 1 奈米左右,但因為發光順序、螢光顏色不同,在重建過程中能夠被電腦清楚區分。

在真實的細胞中,若想以不同嵌合片段(docking strands)標記鄰近的相同蛋白(例如Nup96 dimer, CD20 dimer),則多少需要仰賴運氣。目前的 RESI 使用隨機標記(stochastically labelling),而非直接指定標記種類與位置。

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以 RESI 定位核孔複合體的 Nup96 蛋白(圖d.),可以達到電子顯微鏡的解析度(圖 b.)。本實驗對同一個核孔進行 4 輪標記定位(圖d.),每次得到的定位資訊將重建疊合成最終定位圖。圖片來源:Reinhardt et al. Ångström-resolution fluorescence microscopy. Nature 617, 711–716 (2023).

定位 Nup96 的實驗就是一個例子,榮曼團隊的4種嵌合片段中,需要有 2 種分別標記相鄰的 Nup96 蛋白,才能夠使兩個相鄰蛋白分別依序發光。榮曼強調,得到理想標記的機率,會隨著嵌合片段的種類提升。在榮曼團隊的定位實驗中,RESI 對 Nup96 的定位達到和掃描式電子顯微鏡同等精密的解析度。

榮曼認為:「理論上,透過發光順序的差異,RESI 技術可以分辨無限接近的兩點。」

定位次數帶來解析度新境界

基於光波繞射的性質,點光源的光線不會透過顯微鏡聚焦為理想的一點,而是呈現一個立體球狀照射範圍。這個讓科學家困擾一個半世紀的照射範圍,就是此光學系統的點擴散函數(PSF, Point Spread Function)。

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在顯微鏡焦平面上,PSF 會形成一個中心最亮、四周漸黯的圓形光斑(艾里斑,Airy Disk),若兩個光點的光斑大幅重疊,就會難以辨別。這也就是遠場光學顯微鏡的最大天然障礙:阿貝繞射極限的由來。

包含 PALM, STORM 等超解析技術的單分子定位顯微術(SMLM, Single-Molecule Localization Microscopy)也必須考慮 PSF。它們定位解析度(也稱定位精準度,σSMLM),接近點擴散函數的標準差(σDiff)除以每次定位偵測光子數(N)的平方根:

 σSMLM  σDiff / N1/2

解析度數值愈小,代表辨別極限的距離愈近,定位結果愈清晰。超解析定位技術不斷追求的,就是縮小 σSMLM。

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在點擴散函數標準差(σDiff)隨儀器性能固定的情況下,每次定位偵測的光子數 N 就是定位解析度的主要變數。多數單分子定位技術,都需要設法提升偵測光子數以看得更清晰。

與其他單分子定位術不同的是,RESI 採用的 DNA-PAINT 探針對目標分子反覆結合、脫落,不斷有新的螢光探針前仆後繼,迅速與目標短暫結合,可以對每個目標累積多次定位。

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DNA-PAINT 技術可達到小於繞射極限的解析度,但 10 奈米內的構造依然難以辨識。加上 RESI 以定位順序進行輔助,可以將解析度提升近百倍,達到 10 埃的尺度。圖片出處:S. C. M. Reinhardt et al., Nature 617, 711 (2023)

因此目標的「定位次數」(K)進入解析度數值核心。每個目標定位的解析度由單次定位的點擴散函數標準差(σSMLM),轉變為多次放光定位的平均值標準誤差(SEM, Standard Error of the Mean),其大小和定位次數(k)的平方根成反比。

SEM σSMLM / k1/2 ≈  Diff / N1/2) / k1/2

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此時只要提升定位次數(k),就可以得到更精密的定位(σRESI),毋須追求更強或更漫長的螢光來增加每次偵測的光子數(N)。再搭配以定位順序區分鄰近分子,RESI 就能得到近乎無限小的解析度。這種靈活的反覆定位模式,有賴 DNA-PAINT 技術奇特的「不牢固」結合(transient binding)搭配榮曼團隊研發的開源影像處理軟體Picasso 合力實現。

(DNA-PAINT 技術介紹請見:DNA-PAINT:短暫標記 奈米解析

參考資料

  • Reinhardt, S.C.M., Masullo, L.A., Baudrexel, I. et al. Ångström-resolution fluorescence microscopy. Nature 617, 711–716 (2023).
  • Max-Planck-Gesellshft. Ångström-resolution fluorescence microscopy. (2023)
  • Agasti SS, Wang Y, et al. DNA-barcoded labeling probes for highly multiplexed Exchange-PAINT imaging. Chem Sci. 2017 Apr 1;8(4):3080-3091.
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顯微觀點_96
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