本文轉載自顯微觀點
單分子技術（single-molecule techniques）主要是觀察「個別」分子特性和反應過程；其中，全內角反射螢光顯微鏡（Total Internal Reflection Fluorescence, TIRF）是單分子研究的基礎關鍵技術。
生物研究中，螢光顯微鏡是常見的儀器，利用螢光標記特定的分子。當螢光分子被特定波長的入射光激發，從低能階躍遷至高能階後，掉回原本低階能狀態的過程，便會而釋放出光子，發光成像。
但傳統寬視野螢光顯微鏡會激發整個深度的螢光分子，因此也會同時激發目標區以外的分子而造成雜訊；TIRF 則是利用介質的差異，將照明限制在較淺的深度、約 200 奈米以內，便可有效減少背景訊號。
還記得之前文章曾提過，當光從一種介質傳遞到另一種介質，部分反射，部分因為波速變化而發生折射，例如從水到空氣。
折射角度遵守斯涅耳定律（Snell’s law）：n1 × sinθ1 = n2 × sinθ2
其中，若 n1 折射率較高（光密介質）、n2 折射率較低（光疏介質），光線從 n1 射向 n2。
當入射角 θ1 小於臨界角 θc 時，光線部分往 n2 介質以 θ2 角度折射，部分往 n1 介質以 θ1 角度反射；當入射角 θ1 大於臨界角 θc 時，則沒有折射光線，產生全反射現象。
雖然全反射時，光不會進入第二介質發生折射，但在介面處仍會產生漸逝波（evanescent wave）。漸逝波的頻率與入射光相同，且強度隨與介面的距離增加呈指數衰減，並垂直介面、沿著 z 方向最多達到奈米級的深度。
全反射時在介面處仍會產生漸逝波（左圖），TIRF 顯微鏡利用此作為螢光激發光源，將照明限制在較淺的深度（右圖左）。圖片來源：Olympus 官網
而穿透深度（d） 取決於入射照明的波長（λ）、入射角（θ1）以及介質的折射率（n）。
d = λ/4π × (n12 sin2θ1 – n22)-1/2
TIRF 顯微鏡便是利用這樣的漸逝波作為激發光源，激發樣本介面的螢光分子，產生全反射螢光影像。
TIRF 顯微鏡依據光入射路徑，可分為稜鏡型（prism-based） 與物鏡型（objective-based） 兩類。
在稜鏡型 TIRF 中，在樣本另一側使用稜鏡產生全反射，以激發細胞培養基上的螢光生物樣本，不需要特殊物鏡。但稜鏡型 TIRF 為了要達到較高的解析度，接收螢光的物鏡工作距離較短，樣本和物鏡間的空間較小，限制了研究者進一步對樣本進行操作。
物鏡型 TIRF 則是將物鏡除了作為收集螢光信號的鏡頭外，同時也作為發生全反射的稜鏡。入射光從物鏡邊緣射向樣本，並使用高數值孔徑（NA 通常在 1.45 以上）的物鏡實現大於臨界角的入射角，以產生全反射。
樣本與蓋玻片介面處產生漸逝波，激發樣本表面區域的螢光物質，同時以高數值孔徑的同一物鏡收集螢光顯微鏡影像。
理論上，一般光源也可作為全反射螢光顯微鏡的光源，但前面提到穿透深度與波長、入射角及折射率等都有關係，因此常以雷射作為光源。例如中研院單分子生物核心實驗室就以三個常用波長（485、532、640 nm）的雷射作為光源，並自動調節入射光源角度及漸逝波穿透深度。
由於 TIRF 顯微鏡的可觀察深度僅在 200 奈米以內，因此常結合螢光共振能量轉換法（fluorescence resonance energy transfer, FRET）、光鉗（optical tweezer）等技術，大量地應用在蛋白質、細胞膜等研究。而相較於也能鎖定 z 軸光學切面、不會受到太多背景干擾的共軛焦顯微鏡，TIRF 也能以更快速度獲取細胞膜運送物質，如胞吞、胞吐等作用的影像。
中研院單分子生物核心實驗室負責人黃婉媜便曾提到，由於 TIRF 顯微鏡的可觀察深度僅在 200 奈米以內，恰好細胞膜上非常多離子通道和受體以及訊息傳遞分子都位於此深度內，是研究藥物作用及藥物動力學很好的工具。
