更快、更銳利的四維度電子顯微鏡

本文轉載自顯微觀點

顯微鏡在觀察微小物體上發揮非常重要的作用，但傳統光學顯微鏡通常愈將倍率放大，景深就愈淺，在觀察立體的生物標本或是組織切片，觀察者無論怎樣調焦，依然無法獲得完全清晰的圖片。數位顯微鏡便能解決這樣的問題。

數位顯微鏡和光學顯微鏡最大的差異在於觀察方式。數位顯微鏡不像傳統顯微鏡透過目鏡來觀察，而是使用數位相機獲取畫面，再將即時畫面投影到連接的電腦螢幕。

三要件組成數位顯微鏡

數位顯微鏡結合了傳統光學顯微鏡、數位多媒體和數位處理技術，其成像系統通常包括三個模組：顯微鏡光學模組、資料擷取模組、數位影像處理和軟體控制模組。

顯微鏡光學模組執行顯微成像的功能，將欲觀察的樣本影像聚焦。一旦聚焦，資料擷取模組就會將影像以數位格式儲存在感光元件，如 CCD（電荷耦合裝置‍）或 CMOS‍（互補式金氧半導體），再透過 USB 或其他介面傳輸到電腦儲存裝置。

軟體控制模組則是整個數位顯微鏡系統的核心，可即時控制、優化擷取的影像，並加以處理、分析測量。尤其隨著功能更強大的電腦出現，數位顯微影像可以得到更有效和高效的處理，例如可以取代手動計數功能，或是快速推疊或拼接影像。

D_tot 表示景深，λ 是照明光的波長，n 是物鏡至觀察物體間介質的折射率，NA 是物鏡的數值孔徑

e 是放置在顯微鏡物鏡圖像中，可分辨的最小距離，M 是橫向總放大倍率

從公式可以看到，景深和總放大倍率幾乎成反比。而以過去難以同時兼備的高倍率和大景深來說，使用顯微鏡調整焦點，搜尋並到達分佈在不同深度的樣本後，再以數位成像設備捕捉分佈在這些深度的所有清晰影像，傳輸到電腦就能產生高品質、清晰的影像。

另外，也可結合雷射和共軛焦顯微鏡觀察不同深度的橫斷切面影像，再利用電腦影像處理和 3D 重建演算法，便能可以獲得高解析度的立體輪廓，進而觀察複雜的細胞骨架、染色體、細胞器和細胞膜。

數位顯微鏡的電腦即時處理也常應用在動態或活體（in vivo）檢測的研究中，例如細胞膜潛在變化、藥物進入組織或細胞膜的過程等。

數位顯微鏡的倍率計算

傳統顯微鏡的總放大倍率為目鏡倍率 x 物鏡倍率，既然數位顯微鏡拿掉了目鏡改以數位相機、電腦取代，該如何計算總放大倍率呢？

數位顯微鏡除了光學放大倍率，還必須考慮數位放大倍率，因此總放大倍率＝光學放大倍率 x 數位放大倍率

• 光學放大倍率：物鏡放大倍率 x C 型轉接環放大倍率

由於連接顯微鏡和相機通常有一個 C 型轉接環（C-mount），且內建鏡頭。因此必須先將物鏡放大倍率乘以轉接環的放大倍率。

• 數位放大倍率＝螢幕（顯示器）尺寸／感光元件尺寸

數位放大倍率必須考慮的元素有螢幕和感光元件。通常螢幕的對角線尺寸以英吋為單位，因此必須先將測量值轉換為毫米（mm）；以 19 吋顯示器為例，其對角線測量值則為 19 吋 x 25.4＝482.6 （mm）。

感光元件尺寸同樣以對角線的測量值來計算。以 1” 的晶片來說，其對角線測量值為 16（mm）。

因此若以 10X 的物鏡搭配 0.67X 的 C 型轉接環，變焦 5X 後使用 2/3”CMOS 攝錄器拍攝並投影在 24 吋螢幕上。此時總放大倍率為：10 X 0.67 X 5 X 24 X 25.4 / 11 = 1856.5 （倍）

不過，隨著技術的不斷進步，數位顯微鏡和光學顯微鏡間的界限變得越來越模糊，有些數位顯微鏡採用更多光學元件，光學顯微鏡也採用了數位相機技術；相信打破藩籬的那一天指日可待。

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參考資料

1. Digital vs. Optical Microscopes: An In-Depth Comparison
2. How to Calculate Microscope On-Screen Magnification
3. Chen, X., Zheng, B., & Liu, H. (2011). Optical and digital microscopic imaging techniques and applications in pathology. Analytical cellular pathology (Amsterdam), 34(1-2), 5–18.

• 本文轉載自科技大觀園，原文為《近場光學顯微術，開啟奈米世界大門》
• 作者／簡靖航｜科技大觀園特約編輯

傳統光學顯微技術發展幾個世紀之後，從 20 世紀後半⾄今，突破光學繞射極限成為顯微技術的重要課題。繞射極限是光波所能聚焦的最⼩尺寸（約為光波長的⼀半，以可⾒光來說約 200-350 nm），仍遠⼤於分⼦和奈米材料。顯微鏡的發明是進入微觀世界的⾥程碑，⽽突破光學繞射極限後就能開啟進入奈米世界的可能性。 

突破光學繞射極限的超⾼解析度顯微技術⼤致上可以分為遠場（far field）與近場（near field）兩⼤類，這兩者的差別在於是否利⽤探針在靠近樣品距離遠⼩於⼀個波長（約數⼗奈米）處進⾏量測，若有則為近場，其餘則屬於遠場。⽽遠場顯微技術若要達到奈米級別的超⾼解析度， 需要以特殊螢光標定加上大量電腦計算來輔助。 

中央研究院應⽤科學研究中⼼研究員陳祺，專攻近場光學顯微術，屬於探針掃描顯微術（Scanning probe microscopy, SPM）中與光學相結合的分⽀。 

探針掃描顯微術，家族成員眾多 

探針掃描顯微術泛指使⽤探針來掃描樣品的顯微技術，依照原理的差別再細分成多個類別。在整個探針掃描顯微術家族中，最早的成員為 1981 年問世的掃描穿隧顯微鏡（Scanning tunneling microscope, STM），其主要機制是偵測探針與待測物表⾯間的量⼦穿隧電流（註1），作為回饋訊號來控制針尖與待測物的距離，⽽得到待測物表⾯次原⼦級別的高低起伏。1986 年發明的原⼦⼒顯微鏡（Atomic force microscope, AFM）則是⽬前最廣為應⽤的探針顯微技術，其以針尖接觸（contact）或輕敲（tapping）物體，藉由偵測針尖和物體表⾯間之凡得瓦⼒，得知物體表⾯的高低起伏。 

在探針掃描顯微術中，控制針尖與物體的相對距離是重要的課題，STM 可控制距離在一奈米以下，AFM 則可在一奈米到數十奈米間變化。此外，要在奈米世界「移動」並不是⼀件簡單的事。因為⼀般以機械⽅式的「移動」，其尺度都會在微米級別以上，這就像是我們沒有辦法要求⼤象邁出螞蟻的⼀⼩步⼀樣。所幸 1880 年居禮兄弟發現壓電材料會因為外加電場，⽽導致晶格長度的伸長或者收縮，即可造成奈米級別的「移動」。⽬前所有的探針顯微術都是以壓電效應達成對針尖或樣品「移動」的控制。 

近場光學顯微術，探針加上光 

依 STM/AFM 控制針尖的技術基礎，外加光源於針尖上，即為近場光學顯微術（Scanning near-field optical microscopy, SNOM），依照光源形式的不同可區分為兩⼤類： 

1. 微孔式近場光學顯微術（aperture SNOM，簡稱 a-SNOM） 
2. 散射式近場光學顯微術（scattering SNOM，簡稱 s-SNOM）

a-SNOM 是利用透明的 AFM 針尖，先鍍上⼀層⾦屬薄膜，並打上⼩洞，讓光從⼤約 50-100nm 左右的⼩洞穿出，得到⼩於光學繞射極限的光訊號。s-SNOM 則是外加雷射光源聚焦於針尖上，並量測散射後的光訊號。其中，針尖增強拉曼散射光譜顯微鏡（Tip-enhanced Raman spectroscopy, TERS）是屬於 s-SNOM 的⼀種特殊近場光學模式，主要為量測拉曼散射光譜，即可識別分⼦鍵結的種類。由於拉曼訊號相對微弱，透過探針鍍上⾦屬薄膜，即可利⽤針尖端局域電場的放⼤效果，來增強待測物的拉曼訊號，並利用針尖的移動來得到奈米級空間解析度的拉曼成像。 

陳祺的研究歷程與觀點

在陳祺就讀博士期間，其研究領域主要為結合低溫超高真空 STM 的單分子光學量測，需要極度精進探針掃描顯微鏡的穩定與解析度。畢業之後將⽬標轉向室溫室壓下的探針掃描顯微術與光學的結合，用以量測更多種類和不導電樣品。

陳祺在博⼠後期間的⼯作以 TERS 為主，曾發表解析度⾼達 2 奈米以下的成果，維基百科的 TERS 條⽬，也引⽤了陳祺當時發表在《Nature Communication》的論⽂。回國進入中研院之後，陳祺也開始 a-SNOM 的研究。

無論 TERS 或 a-SNOM，兩者的實驗設計都是建構在 AFM 上，因此陳祺會⾃⾏架設更精準的 AFM，以達成近場光學顯微術更佳的穩定性。 

近場光學實驗操作上的困難除了針尖的製作之外，穩定的 AFM 掃描其實也相當不容易，是維持針尖品質的關鍵。傳統上 a-SNOM 都是以接觸式（contact mode）的 AFM 方式掃描，以防止輕敲式（tapping mode）起伏會干擾光訊號，代價就是 AFM 的解析度極差。陳祺將⾃架的近場光學實驗放進⼿套箱裡，能讓針尖在輕敲式時維持極⼩的振幅（在⼀個奈米以下），可以大幅提高 AFM 的形貌解析度，也幾乎不損傷針尖。由於陳祺有非常豐富⾃架儀器的經驗，才能很⼤程度突破⼀般商⽤儀器的限制。 

⼀般認為 TERS 有較佳的解析度，但由於 TERS 在散射訊號影像上有很大程度的不確定性，經常導致假訊號或假解析度的發生。近年來陳祺反⽽把研究的主軸轉向 a-SNOM，因為她更看重是否能由 AFM 得到的材料結構和高度，來解釋近場光學所量測的結果，以期研究材料背後的物理或化學現象。

另外，陳祺近期最重要的突破是在⽔中完成 a-SNOM 的量測，將針尖與光學元件整合在自製的腔體（cage system）之中，得以在保持生物樣品的活性之下得到超高解析度的影像，這將是開啟利用近場光學研究⽣物課題的重要⾥程碑。

最後，⾝為擁有兩個孩⼦的女性研究員，「如何兼顧⼯作與家庭」或許是⼀般新聞媒體會問的問題。然⽽，陳祺分享⾃⼰的⼼得：「是不可能兼顧的啦！先集中精神做好⼀件事，等另⼀件要爆掉的時候再去救它。」可能坦承⾃⼰沒有辦法做好每件事， 反⽽讓陳祺在實驗上永遠能找到促使⾃⼰改進的動⼒。 

註解

註 1：量⼦穿隧電流：在量⼦世界中，物質同時具有波動和粒⼦的特性。因具有波動的性質， 當電⼦撞擊⼀層很薄的障礙物時，有不為零的機率穿過去，並產⽣穿隧電流（tunneling current ）。穿隧電流與障礙物厚度成指數函數遞減，因此可藉由量測穿隧電流強度計算出待測物表⾯極微⼩的⾼低起伏。

生物體中的蛋白質分子通常長得非常複雜，不是幾行化學式能解決的。如果想把它的分子結構鉅細靡遺的描繪出來，你有幾種選擇。

讓人類發現 DNA 雙股螺旋的 X 光晶體學

其中一個是 X 光晶體學，也就是讓許多蛋白質分子一同排列成整齊的晶體，接著將 X 光打進去，用繞射圖案進行分析。從 1950 年代以來，科學家便常常使用這種技術來探索分子結構。DNA 的雙股螺旋結構便是透過 X 光晶體學被發現。

不過這種方法有其根本上的限制。X 光晶體繞射後的強度很弱，必須藉由晶體內多個重複且整齊的晶格，進行同步繞射來增強訊號，因此沒辦法處理太大的蛋白質分子（單位體積內重複晶格太少），或是結構複雜的蛋白質（像是核糖體是由兩個次單元組成的），而且因為 X 光晶體學仰賴的是晶體結構的繞射，那些無法好好結晶的蛋白質，便不在它的防守範圍內，而細胞中許多的蛋白質都很難形成整齊的晶體。

另外，就算可以成功的結晶，被結晶的蛋白質分子也無法呈現出平常運作時的多種風貌，產生的影像也無法捕捉關於分子的任何動態資訊。

不斷跨越解析度門檻的低溫電子顯微技術

於是我們有另一個選項：低溫電子顯微技術 (cryo–electron microscopy) 。待觀察的分子被凍結在超低溫環境中，而研究人員用電子束轟炸分子，透過電子留下的影像來還原分子的立體結構。這種技術不需要蛋白質進行結晶，不過解析度普遍較差，最後的影像往往只能看出幾個模糊的團塊，因此通常只會用在大的蛋白質分子。

隨著相關領域人員的持續努力，低溫電子顯微的解析度已經大有進展。2017 年的諾貝爾化學獎便是頒給三位科學家在高解析度低溫電子顯微技術方面的突破。前一陣子的紀錄保持者是日本團隊對缺鐵基蛋白 (apoferritin) 的研究，解析度到達 1.53 埃。不過如果想要清楚的呈現個別原子，解析度差不多需要到達 1.5 埃，還差了一些。

在今年十月 Nature 期刊的一篇最新研究中，一個跨國研究團隊利用改良過的電子束與分析軟體，成功達到了 1.25 埃以上的解析率，足以清楚標示出每顆原子的位置。

聽起來很厲害，不過這代表的是什麼？

由於生物分子可以在行動中被降溫並「定格」，我們現在能夠清楚的看見蛋白質這類複雜的分子機械如何運作，清楚到每顆原子的動態都盡收眼底。毫無疑問地，這樣的技術將為分子與結構生物學帶來重要的進展。

目前，原子等級的解析度只適用於結構較堅硬的蛋白質分子。做為下一階段的目標，研究團隊希望能將同樣的技術運用在一般柔軟的大型蛋白質結構，並達到一樣好的解析度。在結構生物學的領域中，使用低溫電子顯微鏡的研究人口逐年成長，而這次的技術突破有望繼續加速這個趨勢。

參考資料

1. Yip, K.M., Fischer, N., Paknia, E. et al. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature 587, 157–161 (2020).
2. Cryo–electron microscopy breaks the atomic resolution barrier at last
3. X-光晶體繞射學與結構生物學