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親愛的,我看到你磷酸化了!

2011/02/09 | 未分類 |

Original publish date:Aug 25, 2004

編輯 youko 報導

科學家利用螢火蟲的螢光酵素(luciferase)來顯示分子間運動的狀況。

生物體中的訊息傳遞路徑(signal pathway)管理著許多重要的功能,細胞週期的進行、新陳代謝等等作用都需要經由訊息傳遞路徑來調控。而在訊息傳遞路徑的調控當中,蛋白質之間的作用扮演了相當重要的角色,磷酸化(phosphorylation)就是一例。

不過訊息傳遞路徑的運作,會依細胞所處組織環境的不同而有所改變,這是不能在體外實驗中忠實呈現出來的一面。因此有人使用正子斷層攝影(PET)或是生物冷光(bioluminescence)的方式,嘗試以非侵入式的方法,來獲得生物體內蛋白質之間作用的過程。而目前偵測蛋白質之間作用的策略包括了活化或抑制轉譯的步驟、活化訊息傳遞路徑,或是還原被中斷的酵素活性。

在酵素活性方面,若將單一蛋白質切成兩半,這兩個片段並不會自行組合而產生作用。只有在這兩個片段能夠經由藥物等其他作用而再度團圓時,才會進行正常的酵素功能。但是螢火蟲的螢光酵素受限於其N端部分所發出的藍綠色光(藍綠色光穿透生物體的效果不佳);水母的螢光酵素應用在生物體上的種種限制,所以現有的螢光酵素系統無法完全滿足非侵入式蛋白質作用造影的需求。

不過最近在美國華盛頓大學的博士後研究員Kathryn E. Luker所領導的研究中,則改進了現有的螢光酵素互補造影系統(luciferase complementation imaging, LCI)。

他們首先製造出不同重疊長度的螢光酵素N端及C端配對,然後使用細菌來觀察這些配對的作用狀況,選出發光度最強的三對,接著觀察這三對螢光酵素組合在生物體中的表現。

在老鼠方面的實驗,他們用選用了兩種因為免疫抑制劑rapamycin而作用的蛋白質,一種稱為mTOR(mammalian Target of Rapamycin)的蛋白質,另一個則是FKBP。他們將mTOR上一個跟FKBP-rapamycin複合物親和性很高的區域──FRB──與螢光酵素的N端部分結合;螢光酵素C端部分則與FKBP結合。結果顯示,只有在rapamycin注入老鼠體內時,螢光酵素片段才會結合而發出螢光,另外在細胞中觀察磷酸化相關的反應也得到很好的效果。

在他們的方法當中,螢光酵素片段在結合時所發出的螢光是背景的1200倍,超過目前現有系統的表現。這使得LCI這個檢測方法的靈敏度大大地提高,也讓偵測一些親和力沒那麼強的蛋白質作用成為可能。這個方法目前正用來進行更多不同蛋白質作用的檢測,不過可預見的是,這個方法將成為一個在藥物篩選上極為有力的工具。

原始論文:

Kathryn E. Luker, et al. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. PNAS published July 29, 2004, 10.1073/pnas.0404041101.

參考來源:

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