人妻的尖叫是繁衍的重要保障嗎？

14 世紀中葉，歐洲各地陸續爆發鼠疫。瘟疫在當時的歐洲並不稀罕，可是這回實在嚴重，大量人口慘遭消滅，後世稱之為「黑死病」。疫情主要發生在公元 1347 到 1352 年，有些學者估計令歐洲在短期內減少 30 到 50% 人口，或許高達 5000 萬人之多。

一項新上市的研究根據花粉分析，卻得到結論：黑死病對歐洲各地的影響差異不小，有些區域確實大受打擊，但是有些地區輕微得多。我們該怎麼解讀這些研究呢？

瘟疫殺死歐洲一半人！真的嗎？

黑死病的病原體是鼠疫桿菌（Yersinia pestis），可藉由老鼠和跳蚤輔助傳播。近年來由遺骸取得古代 DNA 的研究大行其道，令我們得知超過五千年前，便有人感染鼠疫桿菌。鼠疫桿菌能搭乘跳蚤便車，關鍵在於 ymt（Yersinia murine toxin）基因，晚於四千年前的鼠疫桿菌皆已經具備。

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歷史上三次大爆發：6世紀的查士丁尼瘟疫，14 世紀的黑死病，以及 19 世紀末的全球流行，人們面對的都是傳染力升級的細菌版本；除此之外，還有多次規模較小的流行。 遺傳變化有限的病原體，在不同時空的疫情差異很大。

歷次鼠疫桿菌導致的疫情中，黑死病的衝擊最大，有些研究甚至認為它消滅當時歐洲 50% 人口。這類死亡率的評估，主要來自歷史資料，如文書、稅務等紀錄；然而，這類資訊來源未必準確，有時文字會誇大不實，和實際數字有所差異。

還有一點侷限在，歷史資料主要紀錄人口聚居的城鎮，可是黑死病那個時候，歐洲超過 75% 人住在城市之外。人擠人的城市碰上鼠疫這類傳染病，通常受害較大，所以根據城市評估而得的結果，也許會高估瘟疫的危害。

另一方面，不同地區的受災程度很可能不同，就像正在進行的 COVID-19（武漢肺炎、新冠肺炎）疫情，遺傳上相同的病毒重擊秘魯，對澳洲的傷害卻相對有限。而黑死病也是如此，既有資料已經足以看出，相比於義大利深受打擊，波蘭更加輕微。幾處地區的狀況，不能擴大代表整個歐洲。

花粉大數據

要評估黑死病這類歷史大事件的影響，沒有一種理想辦法，一定要從不同方面尋找證據切入、互補，而環境變化可以作為切入點。突然爆發的疾病，導致大量人口死亡之後，也將造成經濟與社會的動盪，可想而知，自然環境也會受到牽連。

新發表的研究選擇以花粉作為指標，探討黑死病的影響，還創造一個看似 fancy 的新名詞描述：「大數據古生態學（big data palaeoecology，簡稱 BDP）」，反正大數據就是那樣。

概念是，受到黑死病負面影響愈嚴重的地區，人類活動會減少愈多，可以由花粉變化看出。具體樣本來自歐洲各地 261 處遺址，一共 1634 個沉積層樣本；年代介於公元 1250 到 1450 年，大致涵蓋黑死病發生之前到之後的各一百年，也就是前後約 4 代人。短時間內大量人口死亡，影響可能延續數代。

不同植物會生成不同花粉，有些花粉落到湖泊等環境，變成湖底的沉積物，有機會保存下來，成為歷史切片的見證。而人類活動影響環境，使得植物生態有別，便會留下不同的花粉組合。

例如農耕發達的地區，會留下大量農作物的花粉，畜牧業普及區則會是另一種風貌；若是人口減少令農牧活動降低，野生植物的花粉便會增加，不同階段又會生長不同野生植物。

地段，地段，地段！

新的分析思維看似很有道理，但是能相信嗎？研究者首先分析資訊最豐富的兩處地點：瑞典、波蘭。許多證據表示黑死病過去後，瑞典慘遭打擊，波蘭反而明顯成長；倘若花粉呈現的狀況一致，便說明這套分析是可靠的。結果花粉分析順利通過考驗。

花粉分析擴大到歐洲全境，最肯定的結論是：各地差異不小。黑死病前後，一些地區差異有限，有些甚至逆風高飛；農牧活動減少最多的地區位於斯堪地那維亞（北歐）、法國、德國西部、希臘、義大利中部。

有個假設是：瘟疫使人口減少以後，產業可能由勞力密集的農耕，轉向較不需要人力的畜牧。但是這回研究指出，所有農耕下降的地區， 畜牧也跟著減少；唯一例外是德國西南部，畜牧反而增長。

考察文獻得知，義大利、法國深受黑死病危害，這也反映在當地的花粉中，證實歷史紀錄的準確。農業開墾往往是森林的敵人，黑死病過後，義大利的森林甚至重新蓬勃復育；慘烈至此，難怪有薄伽丘《十日談》的誕生。

然而不少地區的農牧活動，黑死病前後的差異有限，或是顯著成長，像是伊比利、愛爾蘭，以及中歐、東歐多數地點。這些分析指出黑死病對歐洲各地的影響有別，整體死亡率大概沒有 50% 那麼誇張。

其實還是不清楚黑死病的死亡率

該如何看待上述論點呢？花粉分析有優點，也有缺點。一如文字、稅務等切入方向，花粉也有自己方法學上的侷限。它能告訴我們歐洲各地的死亡率不均值，卻無法真正評估死亡率高低。

根據花粉組成在不同年代的相對變化，可以推論當地農牧活動的改變，卻不直接等同於人口的死亡程度。

一個地區在黑死病後一段時間，農牧活動明顯增長，不見得意謂瘟疫時沒有死很多人，也可能是恢復速度很快，或是還有黑死病以外的其他因素。

也要注意這兒的評估是相對的，某地相對的受災比較輕微，不等於災情不嚴重。一個地區在幾十年的時段內，如果損失 30% 人口當然是大災難，但是就算死亡「只有」5%，也不可能馬照跑，舞照跳。

評估大瘟疫更廣泛的社會影響

儘管無法準確判斷死亡率，花粉能評估傳染病對社會更廣泛的影響。黑死病這類大瘟疫，不是只有鼠疫桿菌殺死多少人而已，還會牽連更廣泛的社會運作，累積間接傷害。

• 延伸閱讀：歷史大瘟疫：黑死病重塑社會貧富

即使是一個較小的地理範圍，受災程度也可能有內部差異，如城鎮中心及其周圍的郊區、鄉村。沉積物中的花粉，是一個地區一段時間內的集合紀錄，似乎較能避免城鄉差距的影響。

有學者認為，黑死病過後一個地區之所以沒有衰退，也可能是外地人口填補所致，故質疑新研究的論點。就算真是如此，新遷入的人口也是來自歐洲其他地方，同樣支持新論點的大方向：歐洲各地受災程度有異，並非每處一樣嚴重。何況過往公認疫情嚴重的地區，新分析中也看得出來。

有趣的是，一項 2019 年發表的研究在檢視多重證據後，也認為查士丁尼瘟疫的災情言過其實，不如過往認知的那麼嚴重。提醒各位千萬不能忽略「沒有那麼嚴重，跟不嚴重是兩回事」。

花粉無法回答的問題是：黑死病為什麼在各地影響有別？有人推測是鼠疫桿菌的品系不同，在西歐的殺傷力較強，東歐較弱。但是此一論點缺乏遺傳學、病理學的證據。

2019 年底至今的全球瘟疫清楚告訴我們，遺傳上一模一樣的品系，在不同國家的傳播與傷害天差地別，涉及許多複雜的因素。黑死病比當下冠狀病毒造成的疫情嚴重很多，基本道理大概還是一樣的。

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參考資料

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2. Spyrou, M. A., Tukhbatova, R. I., Wang, C. C., Valtueña, A. A., Lankapalli, A. K., Kondrashin, V. V., … & Krause, J. (2018). Analysis of 3800-year-old Yersinia pestis genomes suggests Bronze Age origin for bubonic plague. Nature Communications, 9(1), 1-10.
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4. Black death mortality not as widespread as believed
5. Did the ‘Black Death’ Really Kill Half of Europe? New Research Says No
6. Mordechai, L., Eisenberg, M., Newfield, T. P., Izdebski, A., Kay, J. E., & Poinar, H. (2019). The Justinianic Plague: an inconsequential pandemic?. Proceedings of the National Academy of Sciences, 116(51), 25546-25554.

本文亦刊載於作者部落格《盲眼的尼安德塔石匠》暨其 facebook 同名專頁。

• 本文轉載自科技大觀園，原文為《人鼠之間：生醫研究的幕後英雄——實驗鼠》

• 作者 / 林妤庭｜科技大觀園特約編輯

作為世界各國生醫研究的推手，每隻基改實驗鼠都是具有個性、生命力充沛的個體，就和我們每個人一樣！國家實驗動物中心副主任秦咸靜表示，牠們不只是實驗材料，更是新藥開發的大功臣，值得享有更多尊重和福祉。

「你可以想成這裡養了數十萬隻寵物，獸醫師會定期幫動物巡房、做健康檢查；也像是『不孕症中心』，有大量被冷凍保存的動物胚胎，有需要時解凍來用；還有各種類似醫院專科門診的單位，包括行為、腦神經、代謝、腫瘤等，會固定幫這些小鼠做實驗，」國家實驗研究院國家實驗動物中心副主任秦咸靜形容。

秦咸靜對這裡飼育的大小鼠如數家珍，這些長期近親培育而得的實驗鼠，每個品系就像是一群多胞胎，有自己獨立的個性，有的脾氣硬、愛爭執，有的精神脆弱，禁不起一絲打擾。「像 B6 是 party animal ，愛喝酒，也愛吃甜食和高油脂的食物，媽媽把小孩生下來就跑出去玩；但如果是 FVB 品系，你餵牠酒，牠會堅持等水喝，而且很會照顧小孩！」秦咸靜說。

基因改造「特製」實驗鼠

這些實驗鼠對於研究有非常重要的貢獻。為了更精準的解決研究問題，研究者可以透過將老鼠基因序列增加、刪減、替換，破解基因對於身體功能或者疾病發展的影響。國研院動物中心就是透過基因改造鼠，一路抽絲剝繭，找出多囊腎病變真正關鍵的家族遺傳基因，為治療因多囊腎病而須洗腎的病患，喚起了一線生機。

現今實驗鼠全世界有 2 萬多個品系，其中絕大多數都是基因改造鼠。「螢光鼠」是箇中代表，變色基因就像是在實驗鼠體內裝進了探照燈，協助追蹤器官或細胞移植後發生了什麼事。目前的技術還可以依照需求調控變色，例如給原本紅色的螢光鼠某一種藥時，同時啟動綠色螢光基因，事後觀察顏色的改變，就可以清楚對照出給藥前後細胞在體內的變化。

這些基因改造鼠，也是人類對抗疾病的第一道防線。2015 年，國研院動物中心研發出高度免疫不全的「擬人鼠」，2019 年，再將這些幾乎失去所有免疫細胞的小鼠，進一步接種人源腫瘤，成為個人化新藥試驗的替身——阿凡達鼠，作為癌症治療及研究的重要工具。

秦咸靜解釋，腫瘤跟免疫是臨床前試驗失敗率很高的兩個領域。使用老鼠腫瘤獲得的結果，和應用在人體上可能有很大落差。傳統上，使用人類的腫瘤細胞株進行測試，細胞株可能源於數十年前某個病人身上採到的腫瘤組織，但在實驗室經過了漫長歲月，早就與原本的腫瘤大不相同。

「我們希望顛覆測試的方式，最好可以直接拿病人的來做，最準！」只是人的腫瘤移植到老鼠身上，很容易就被免疫系統攻擊，產生組織排斥。所以第一步，就是讓老鼠不要有免疫系統。這些成功在老鼠身上長大的腫瘤，冷凍保存後可以成為一個「銀行」，日後提供其他有類似基因變異的病人使用，找到適合藥物。目前也正在研究如何將老鼠的免疫系統換成人類的免疫系統，更真實模擬人體環境，也可擴大測試更多與免疫反應有關的藥物。

從「擬人鼠」到「器官晶片」

在精準醫療的發展上，現在甚至已經有老鼠跟人同步測藥的嘗試。給予病人第一線標靶藥物的同時，也直接將腫瘤種到老鼠身上，尋找第二線對病人有效的標靶藥物，免去在眾多標靶藥物中「盲測」而流失的生命和時間。「很多癌症病患等不到有效的藥，吃了第二段標靶藥還是沒有效就走了。」秦咸靜說，雖然目前技術還未全面到位，而且在這樣的時間壓力下，要維持高效率、高成功率，非常考驗臨床動物實驗的能力，但這依然是未來值得發展的方向。

更進一步，「這些從人的腫瘤擴增出來的檢體，未來也可以變成器官晶片，也就是把腫瘤養在晶片上來篩藥，不一定要用老鼠。」秦咸靜認為，隨著技術的進展，除了能建立很多過去想像不到的檢測方式，研究人員也希望搭建出新的機制、新的平台，減少實驗動物的犧牲。

尊重每一次的動物實驗

國研院動物中心擁有全球頂尖的基因改造技術和珍貴的稀有鼠，名列 23 個國際種源庫之一。秦咸靜認為，臺灣有非常強勁的研究能量，對於實驗動物的管理和品質，在亞洲也算是數一數二；不過她也期望，對於動物實驗的教育可以更深入扎根。

「動物牠不是材料，而是生命。如果今天要在一篇論文裡選一個位置去放牠，我們應該要放在致謝，而不是材料。」秦咸靜道出她的感悟。

當思維模式轉變，進行動物實驗規劃時自然就會更有策略、更謹慎，而不是一股腦地直接做動物實驗，或是因為實驗設計不夠精準而一再重來。秦咸靜說明，其實現在大部分實驗希望多軌進行，可以用細胞或電腦模擬的方式先做，若要進行動物實驗，則要好好把握機會，規劃完整並做到好，才不會無謂的消耗生命。至於實驗動物的生活環境，就像養寵物一樣，該換籠就換籠、該清潔就清潔，讓牠們吃好、住好。這些動物帶著實驗的宿命而生，如果人還不能好好照顧牠們，是實驗上最大的殘忍。

以愛來照顧實驗動物，不只是動物福祉的展現，讓牠們的身心靈維持穩定，對於得到準確的生理數值也有幫助。秦咸靜舉例，如果照顧者採血太粗魯、環境太吵、飲食不周，動物一下子心情好、一下子心情不好，生理值高低起伏，當然測不準。

「很多我們覺得很簡單的概念，在學校或是進了實驗室不一定有人教。這些老鼠看起來很單純，其實一點都不單純。」國研院動物中心也積極開課、推廣，期待提升各界關注實驗動物福祉的意識，並建立足夠的訓練機制，不要再從錯誤中學習。

在古代有飛鴿傳書，在霍格華茲裡更有貓頭鷹負責寄送會發出聲響的信件。信件不僅是文字、訊息往來的方式，現今更可直接作為生物材料的寄送媒介。研究團隊發現，經冷凍乾燥處理的小鼠精子，可於沒有液態氮的環境中妥善保存，並且在室溫下帶於普通郵件中寄送。

傳統保存方式：充滿液態氮的超低溫環境

典型保存精子的方式，是將精子保存於液態氮或乾冰中，極低溫的環境可讓精子處於冷凍的狀態下進行運送。待解凍之後，會再透過人工授精或是試管外（in vitro）授精來繁衍後代^[2][3] 。然而，使用液態氮仍可能會產生一些問題，例如，在 196℃ 超低溫度下，進行樣本處理需要非常小心，因為液態氮可能會造成凍傷或是並且因飽和氣體造成窒息等問題，並且在部分國家及地區也可能有難以取得液態氮的問題。

除此之外，為了要讓小鼠精子一直維持在極低溫的環境，需不斷地補充液態氮，這也會造成昂貴的花費。因此，對於部分國家的研究機構來說，這樣難以保存小鼠基因來源。更不用說，若遇到停電、大災難等突發狀況可能會導致的極低溫的環境受到影響，小鼠精子解融、退冰，並導致精子無法使用。

玻璃安瓿保存法很讚，但仍不適合長期保存

為了解決低溫環境難以控制的問題，日本山梨大學（University of Yamanashi）生殖生物學家 Daiyu Ito 的研究團隊發展出一項技術，將小鼠精子放入細頸瓶或玻璃安瓿（Ampoules，一種形狀類似保齡球瓶的小型玻璃瓶，常用於盛裝藥品等溶液。）並置於 4℃ 的環境中三個月，然後再放置於室溫中 1 個月。經過冷凍乾燥處理，可放置於室溫環境中一年。雖然經過處理後的小鼠精子已死亡，無法移動，但精子中的 DNA 仍然維持完整性^[4]。

爾後，再將這些冷凍乾燥後的小鼠精子在注射入卵子時，一樣能繁衍出正常的後代。這項冷凍乾燥的技術已運用與許多物種，例如實驗小鼠、倉鼠、兔子、馬以及綿羊等物種^[5]。然而，使用玻璃安瓿仍有一些缺點。Daiyu Ito 說：「雖然玻璃安瓿的體積小，但它們相當笨重且易碎，容易影響小鼠後代的繁衍。所以將小鼠精子儲存在玻璃安瓿並不適合用來長期保存。因此，我們希望發展新的保存技術。」

紙類保存凍乾精子有搞頭，但哪種材質最適合？

為了找出最適合用於保存冷凍乾燥的小鼠精子（mouse FD spermatozoa）的材料，研究團隊檢測了六種材質，分別是：日式傳統和紙（Washi）、包裝紙（Wrap）、乙烯基板（Vinyl sheet）、秤量紙（Weighing paper）、過濾紙（Filter paper）、日式糖果紙（Oblate）。

首先，過濾紙（Filter paper）是不可以使用的，因為小鼠精子容易卡在紙上，並且在解凍時無法順利取出精子。日式糖果紙（Oblate）也被認為無法作為保存材料，原先認為當日式糖果紙全部溶解於水中，就可以輕易地將冷凍乾燥的精子取出。然而，實際試驗後才發現，日式糖果紙溶解時仍會有部分殘餘物，導致難以收集小鼠精子。此外，其餘的四種材料雖然可用於收集小鼠精子，但仍有一些小缺點，例如：包裝紙太容易撕破，乙烯基板則在乾燥的過程中容易損失精子。

相對來說，日式傳統和紙是個較好的材料，但是在於脫水後的恢復過程中容易汙染，使得收集小鼠精子會遇到困難。秤量紙相較於乙烯基板較薄，但比包裝紙還要硬，是可作為小鼠精子乾燥過程的材料。因此，在此六種材料中，秤量紙是最適合用來處理小鼠精子的。

且經實驗發現，無倫是保存在玻璃安瓿或四種材料（傳統和紙、包裝紙、乙烯基板及秤量紙）的冷凍乾燥小鼠精子，其精子受精率（fertilization rates）沒有顯著差異。然而，在胚胎的發展成桑葚胚（morulae）或囊胚（blastocyst）的比率，最高的是以秤量紙（Weighing paper）包裝的小鼠精子。

使胚胎妥善的發育的比率，是作為小鼠精子是否有成功保存最重要指標，而在四種材料中，使用秤量紙（Weighing paper）包裝的小鼠精子其後代存活率數值為 21%，後代存活比率數值最高。考量到精子發育的程度，以及材料操作容易程度，最後採用秤量紙包裝冷凍乾燥精子，並用塑膠片作為分隔是最適合的選項。

塑膠片會影響精子的DNA完整度嗎？

為進一步了解使用塑膠片保存精子是否會影響精子內的 DNA，研究團隊藉由彗星分析法（comet assay），來比較玻璃安瓿和塑膠片的精子中 DNA 的完整性。彗星分析法可用來檢測單細胞中 DNA 的損害程度，若 DNA 有損害，其結構會較為鬆散，斷裂或破碎的 DNA 片段會在進行電泳（gel）時被拖出細胞，在顯微鏡之下會呈現出一個類似彗星的形狀。不同程度的 DNA 損傷則會造成拖尾程度的差異，至於未損傷的 DNA 則會保持球狀。

從觀察結果得知，保存於玻璃安瓿的小鼠精子 DNA，其彗星尾相較保存於塑膠片的小鼠精子 DNA 慧星尾長度稍短一些，不過，就統計結果而言，兩者之間有顯著差異。

但另方面，在小鼠精子進行細胞質內精子注射（ICSI）之後，藉由使用 γ-H2Ax 染色來比較玻璃安瓿和塑膠片的雄原核（male pronucleus）中 DNA 損壞程度，結果卻發現，相較於保存在塑膠片的小鼠精子，保存於玻璃安瓿的小鼠精子經 γ-H2Ax 染色後，其雄原核^[註2]有較高的亮度，顯示此細胞核內的雙股 DNA 損壞較為嚴重。

綜合上述，保存於塑膠片中的小鼠精子 DNA 完整度，與保存於玻璃安瓿的小鼠精子 DNA 完整度，是可以相比擬的。

如何製備冷凍乾燥的小鼠精子？

小鼠精子經過預先培養之後，會秤量紙作為載體，將含有精子的溶液滴定於秤量紙上。將鋁箔紙摺出一個凹槽，依序放入裁切好的塑膠片及帶有小鼠精子的秤量紙，然後將整包鋁箔包放入保麗龍盒，最後在保麗龍盒內加入液態氮。

接下來，將冷凍的精子溶液乾燥，乾燥之後的冷凍小鼠精子會呈現粉末的狀態。然後，將冷凍乾燥後的小鼠精子取出，並用兩張秤量紙包裝，最後放在塑膠片上並用膠水將其密封起來。待需要使用時，再用剪刀將塑膠片剪出一個缺口，並用鑷子取出小鼠精子，最後再用水回溶精子。

凍乾的小鼠精子，可在室溫下藉由明信片運輸

雖然相較於保存在 -30℃ 的環境，冷凍乾燥（freeze-dried，FD）的小鼠精子保存在室溫環境下三天，其後代存活率較差，但仍可繁衍出後代。利用塑膠片保存的小鼠精子可以夾帶在明信片中，並放置於 -30℃ 的環境。待到要寄信的那天，可直接利用普通郵件的方式寄送，不需額外的保護措施。而收到郵件後，只需再將小鼠精子放回 -30℃ 的環境即可。

研究團隊曾使用此方式，將冷凍乾燥後的小鼠精子從東京大學寄至山梨大學，兩校之間的距離約為 200 km，並且郵件會在 2 天之內寄達。而這些冷凍乾燥的小鼠精子也能順利進行胚胎發育。因此，冷凍乾燥的小鼠精子，是可在沒有其他保護措施之下，在室溫下藉由明信片寄送。

使用信件運輸小鼠精子的優缺點

Daiyu Ito 說：「遺傳資源對於人類未來而言，是個重要資產。即使有許多遺傳特徵可能已不適用於生存，但這些遺傳資源可能有利於某些物種在環境變遷或未知疾病擴散時存活下來。」哺乳類動精子保存，有利於不孕、維持品系中修飾過的基因序列。這個使用塑膠片夾帶小鼠精子的方式，可以方便保存數千種的小鼠品系（strain），除了有利於實驗室及研究機構間的合作往來，更可以促進生殖技術及科技的發展。

然而，使用如此方便及簡易的運送方式，可能會造成許多不合法的運輸過程發生，因此需有更完善的法規制度來審查及保護動物精子的運輸。

註解

1. 受精卵會在 24 小時分裂成 2 細胞，約 48 小時分裂成 4 細胞，約 72 小時分裂成 6~8 細胞，並在約 96 小時分裂成桑葚胚（Morula）；之後才會形成囊胚（Blastocyst）。
2. 雄原核，指的是在受精之後，精核進入卵子內，但尚未於雌原核（female pronucleus）融合。

參考資料

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