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強力提升RNA干擾抑制基因效能的新方法

一支由美國冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboraotry)科學家們領導的研究團隊業已研發出一種強有力的方法,來一次從數千候選的U形RNA(hairpin-shaped RNA)分子中,精挑細選出那些有效抑制標的基因活性的RNAs。目前,該項成果將使生物學家們得以充分利用RNA干擾。RNA干擾是科學家們,為了諸如搜尋癌腫基因、阻止病毒感染及最近於臨床試驗中治療疾病等多種目的,早已共同選用的細胞自然機制。

圖片引用自原文

與同屬冷泉港實驗室暨霍華德休斯醫學研究所(Howard Hughes Medical Institute)研究員Gregory Hannon博士,共同領導該團隊的研究員Scott Lowe博士宣稱:「理論上,RNA干擾是種能被用來解體任何有利害關係之基因的強有力工具,不過實際上一直不易執行。」主要挑戰是難以找到觸發RNA干擾的適切分子,這種觸發物是RNA的細小片段,其藉由附著於標的基因的RNA相稱片段上,來毀壞標的基因,從而抑制來自那基因的蛋白質產生。Hannon解釋:「就取決於為蛋白質合成指定遺傳密碼之RNA大小的每一基因而言,潛在上有500到5000個不同的小RNA能觸發RNA干擾。其中多數是無法徹底抑制基因活性,或是最後僅鎖定導致所謂"偏離標的效應"(off-target effects)之不同基因的弱觸發物。於實驗室中,上述任一腳本的觸發物會毀掉使用RNA干擾來研究疾病的實驗,或更糟的,在臨床上導致無用、甚至有害的療法。Lowe宣稱:「挑選出合適的觸發物,一直如同大海撈針般的困難。」

在發表於2011年2月24日網路版《分子細胞》(Molecular Cell)雜誌的一篇論文中,來自Lowe及Hannon實驗室的科學家及其同僚們說明了,他們如何成功解決上述問題。以RNA干擾技術先驅Hannon的一項概念為基礎,及使用於Lowe實驗室研發的分子工具(molecular tools),該團隊設計了一次能分析數千個,於細胞中能抑制有利害關係之基因的短U形RNA(shRNA)分子,並確認最有效能之RNA干擾觸發物的分析法(assay)。

在找尋9個標的基因(包括幾個難以抑制的癌腫基因)最有效能之RNA干擾觸發物的試驗性實驗中,該團隊獲得了2萬個可能抑制上述任一標的基因之shRNAs的遺傳密碼。之後,每一遺傳密碼被嵌入也被工程改造來具有標的基因的逆轉錄病毒(retrovirus:作為感知物),及供作(被稱為標記)螢光蛋白質的基因中。此設計確保了,於培養皿中成長的細胞感染了遺傳上經工程改造的病毒時,在每一細胞中,上述感知物及標記能始終連同shRNA一起被產生。

在觸發RNA干擾上,無效能的shRNAs無法毀壞標的基因及螢光標記基因的RNA。因而此些細胞產生了亮度能被輕易偵測的螢光蛋白質。不過,有效能之RNA干擾觸發物的shRNA能有效毀壞標的基因及螢光標記基因的RNA。因而,此些細胞沒有任何螢光蹤跡。

與博士後特別研究員Johannes Zuber一起進行上述實驗的研究生Christof Fellmann解釋:「之後,所必須做的是,揀選出此些細胞,進而離析出每一細胞的遺傳物質及排序shRNA。這能確認出,於抑制標的基因上,最有效能的RNA干擾觸發物。」

該團隊發現,就上述9個基因而言,對付每一基因的所有可能shRNAs,約僅2.5%能有效抑制活性。此方法的成就也意味著,科學家們可能不再需要仰賴,當前在斷言哪個shRNA最能起抑制任何已知基因之作用上,往往不精確的演算法(algorithms)。

Hannon宣稱:「目前,依然鮮少有關小RNA生源說(biogenesis)的瞭解。上述分析法業已使得人們能以先前不可行的規模來探索此過程。」分析上述2萬個shRNAs(特別是那些從標的基因已有效被抑制之細胞取得的)的科學家們業已揭露,深入上述過程的洞察力及徹底改善產生有效能RNA干擾觸發物的方法。Lowe宣稱:「就shRNA合乎邏輯的設計而言,他們的分析法賦予了人們強有力的架構。」

該項研究是由美國國家癌症研究所(the National Cancer Institute)及唐蒙帝紀念研究基金會(the Don Monti Memorial Research Foundation)所資助。

原文網址:New method powerfully boosts efficiency of RNA interference (RNAi) in shutting down genes
翻譯:peregrine | 本文轉載自PEREGRINE科學點滴

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